ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 13.

ВИДІЛЕННЯ І КУЛЬТИВУВАННЯ АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ

ГВОЗДИКИ (ТРОЯНД, СМОРОДИНИ). МІКРО РОЗМНОЖЕННЯ ГВОЗДИКИ ЖИВЦЮВАННЯМ

МЕТА: оволодіти методиками виділення, культивування апікальних меристем та мікроклонального розмноження живцюванням гвоздики.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: пагони гвоздики (троянди, смородини); бінокулярна лупа або мікроскоп біологічний порівняльний; стерилізовані скальпелі, препарувальні голки, бритвочки, затиснуті в тримачі; пробірки із стерильним поживним середовищем для культивування експлантів різних рослин; спиртівка; сірники; 96%-й спирт у фарфоровому стаканчику.

Пояснення

Апікальна меристема – це ділянка стеблового апексу, яка розміщена дистально відносно найбільш молодого листкового примордія і має довжину в середньому 80 мм. Культура апікальних меристем широко використовується для створення рослинного матеріалу, вільного від фітопатогенів і, зокрема, вірусної інфекції.

Мікроклональне розмноження – це масове безстатеве розмноження в культурі in vitro, за якого отримані рослини ідентичні вихідній батьківській формі. Весь процес мікроклонального розмноження охоплює три стадії:

1.     Ініціація асептичної культури.

2.     Індукція множинних пагонів при повторному пасажуванні на середовищі для розмноження.

3.     Підготовка сформованих in vitro рослин до висадки в ґрунт.

Порівняно з традиційними методами розмноження, які використовуються в сільськогосподарській практиці, мікроклональне розмноження має низку переваг:

-                    коефіцієнт розмноження значно вищий (з однієї бруньки протягом року можна отримати 5-10 тис. рослин-регенерантів);

-                    можливість підтримувати ріст рослин протягом року;

-                    велика кількість рослин може рости на відносно невеликій лабораторній площі;

-                    оздоровлення рослин від вірусів і патогенних мікроорганізмів;

-                    можливість вести відбір рослин з селекційно-цінними ознаками;

-                    довгострокове збереження рослин у пробірках за низьких температур, що дозволяє створювати банк цінних генотипів і в міру необхідності включати в селекційний процес.

У цілому метод мікророзмноження ґрунтується на індукованому цитокінінами розростанні пазушних меристем, кожна з яких дає початок пагонам. Після формування пагона його розділяють на живці і переносять на свіже поживне середовище. При живцюванні гвоздики використовується живець з одним міжвузлям.

Основними факторами, що впливають на процес мікроклонального розмноження, є фізіолого-біохімічний стан експланта, склад поживного середовища і умови культивування.

ХІД РОБОТИ

1. У стерильних умовах під бінокулярною лупою проводять вичленення меристеми розміром до 1 мм, відсікаючи ланцетом примордіальні листочки.

2. Ізольовані таким чином меристеми переносять на рідке або тверде поживне середовище, яке містить:

макроелементи МС 100 мл,

мікроелементи 100 мл,

Fe-хелат 5 мл,

вітаміни МС 1 мл,

бакто-трінтон 1 мл,

сахарозу 30 г;

рН 5,5-5,6.

3. Меристеми інкубують за температури 25-26^оС з годинним фотоперіодом та інтенсивністю освітлення 150 лк у перший місяць культивування і 500 лк протягом другого місяця. Сформовані із меристем пагони довжиною до 3 см переносять у пробірки на середовище для укорінення.

4. При мікроклональному розмноженні гвоздики пагони розрізають на живці довжиною 3-5 мм з однією пазушною брунькою.

5. Мікроживці поміщають у пробірки на поживне середовище, яке містить:

макроелементи МС 100 мл,

мікроелементи МС 1 мл,

Fe-хелат 5 мл,

вітаміни МС 1 мл,

кінетин 0,25 мг,

сахарозу 20 г,

агар 8 г,

Н₂О 870 мл;

рН 5,6-5,8 (до автоклавування).

6. Культивування проводять на світлі за температури +23-25^оС, 14-годинного фотоперіоду, інтенсивності освітлення 1000 лк.

7. Живці вкорінюються і дають пагони впродовж 3-4 тижнів після введення в культуру.