ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 12.

МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ КАПУСТИ БІЛОГОЛОВОЇ

МЕТА: оволодіти методикою мікроклонального розмноження капусти білоголової.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: насіння і рослини білоголової капусти; бінокулярна лупа або мікроскоп біологічний порівняльний; стерилізовані скальпелі, препарувальні голки, бритвочки, затиснуті в тримачі; пробірки із стерильним поживним середовищем для культивування білоголової капусти; спиртівка; сірники; 96%-й спирт у фарфоровому стаканчику.

Пояснення. Для розмноження рослин in vitro потрібно ввести в культуру будь-який первинний експлант. Фактично будь-який орган або тканина можуть бути джерелом експлантів, однак успіх при цьому буде різним. Так, при використанні як експланта стебла або листка важливо враховувати, з яких частин рослини (верхніх чи нижніх) береться тканина, її вік і фізіологічний стан. Часто на морфогенез експланта впливає сезонність.

При розмноженні самонесумісних ліній капусти як первинний експлант можна використовувати стебло, взяте з підгонів качанів-насінників і викликати на ньому in vitro пагони із сплячих бруньок. У цьому випадку з однієї і тієї ж рослини можна одночасно отримати насіння і вегетативні нащадки, які протягом осінньо-зимових місяців можуть бути значно збільшені багаторазовими пересадками і розмноженням у культурі.

Найбільш зручним експлантом є насіння. Воно легко стерилізується і його можна вводити в культуру у будь-який час року, не маючи труднощів, пов’язаних з попереднім підрощуванням рослин до висадки у пробірки.

Хід роботи

1. Перед посадкою на поживне середовище проводять стерилізацію експланта. Для цього його послідовно поміщають у 96%-й спирт на 10 с (для кращого змочування) і в перенасичений розчин хлорного вапна на 12 хв. Потім двічі промивають у стерильній воді. У тих випадках, коли як експлант використовують насіння, для зручності стерилізації і промивання його попередньо поміщають у марлевий мішечок

2. Простерилізований матеріал поміщують в стерильну “книжку”, де з ним проводять необхідні маніпуляції.

3. Скальпелі і пінцети стерилізують гарячим спиртом (обпалюють на спиртівці).

4. Насіння або ділянки стебла стерильним пінцетом переносять у пробірки з поживним середовищем. Середовище, на яке висаджують насіння, містить (на 1 л): агар - 7 г; солі - за Мурасиге-Скугом; Fe-хелат - 5 мл; сахарозу – 30 г; тіамін - 1 мг; аскорбінову кислоту - 1 мг та індолілмасляну кислоту - 1 мг.

5. Після посіву щільно закриті пробірки ставлять на світло у світловій кімнаті (10-15 тис. люкс), де насіння проростає.

6. Через 3-4 тижні після проростання насіння рослини досягають фази 5-6 листків і готові до живцювання. З цією метою у рослин в пробірці з допомогою пінцета обривають листки. Стебло скальпелем ділять на дві-три частини, кожна з яких містить вузли, міжвузля стебла і залишки черешків листків. Живці висаджують на поживне середовище, яке містить (на 1 л): солі - за Мурасиге-Скугом, Fe-хелат, сахарозу - 45 г, вітаміни (тіамін - 1 мг, аскорбінову кислоту - 1 мг), 6-БАП - 3 мг).

7. Якщо первинним експлантом використовують частинки стебла, то їх після стерилізації і промивання зразу ж поміщають на середовище з БАП. Частинки рослин переносять в умови інтенсивного освітлення за температури 20-25^оС.

8. Через два тижні при основі листків розвиваються пазушні пагони. Одночасно знизу живці обростають щільним калусом вузлоподібної форми, на якому ще через тиждень утворюються адвентивні пагони (всього від 1 до 9 в одній пробірці).

9. За необхідності калус або утворені рослини-регенеранти можуть бути повторно висаджені на свіже поживне середовище, яке містить БАП, де знову утворюються пагони. Багаторазове пересаджування одержаних пагонів (кожні 3-4 тижні) на середовище, яке сприяє пагоноутворенню, може значно збільшити коефіцієнт розмноження білоголової капусти.

10. При розмноженні за допомогою пагонів-регенерантів необхідно враховувати, що добре розвинуті регенеранти дають повторні пагони в першому ж пасажі, у той час як дрібні і адвентивні – у другому-третьому пасажах, після того як підростуть.

11. Розмноження рослин за обмеженої кількості пасажів рекомендується проводити з використанням БАП у дозі 3 мг/л. Якщо розмноження проводять довгий час (8-9 пасажів), то доцільно знизити дозу БАП до 0,5 мг/л або змінювати дози у пасажах, що чергуються.

12. При багаторазовому використанні стимулятора БАП сторонні ефекти, які перешкоджають утворенню нормальних рослин, практично відсутні.