ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 10.

ОТРИМАННЯ КЛІТИННОЇ СУСПЕНЗІЇ З КАЛУСНОЇ ТКАНИНИ

МЕТА: навчитись методів отримання калусної тканини.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: калусна культура картоплі (тютюну, топінамбура), вирощена на середовищі для калусу картоплі (№1), колби Ерленмейєра на 250 мл з рідким (без агару) середовищем для калусу №1 (100мл середовища на колбу), стерильні чашки Петрі, фольга, пінцети, скальпелі, спирт, спиртівка, ламінар-бокс, шейкер, стерильні лійки з нейлоновими фільтрами.

Пояснення

Клітинна суспензія – це окремі клітини або клітинні агрегати, які вирощують у рідкому живильному середовищі в умовах постійної аерації. Вирощування клітинних суспензій у рідкому середовищі має низку переваг над вирощуванням калусних тканин поверхневим методом. Тут легше впливати на метаболізм і ріст клітинних популяцій екзогенними факторами; вони зручніші для біохімічних і молекулярно-біологічних експериментів.

Основним способом отримання суспензійних культур є занурення шматочка калусу в рідке середовище, яке переміщується. Для ініціації суспензійної культури потрібно 2-3 грами калусної тканини на 60-100 мл рідкого живильного середовища. Первинну суспензію отримують на шейкері (вібраторі), який має швидкість перемішування 100-120 об./хв.

Суспензійну культуру можна отримати з фрагмента органа, однак це трудомісткіший шлях, який потребує більше часу: клітини експланта мають утворити первинний калус, який розпадається на окремі клітини.

Оптимальною для отримання високодиспергованої суспензійної культури є пухка обводнена калусна тканина, вирощена на середовищі 2,4-Д, без іонів Са²⁺.

Для вирощування клітинних суспензій використовують в основному ті ж живильні середовища, що й для калусних культур. Але є низка середовищ, призначених безпосередньо для вирощування суспензійних культур.

Первинну суcпензію перед субкультивуванням фільтрують через один-два шари марлі, нейлонові або металеві ситечка, щоб позбутися великих, щільних грудок калусної тканини, залишків експланта або дуже великих агрегатів. Фільтрування рекомендується і в декількох наступних субкультивуваннях до набуття клітинною суспензією бажаних ознак. Як правило, тривалість пасажу при культивуванні клітинних суспензій становить 14-18 днів. Густина популяцій за цей проміжок часу досягає 10⁵ – 5х10⁶ клітин на 1 мл.

Ріст суспензійних культур можна оцінити за одним або кількома параметрами:

1) об’єм осаджених клітин (ООК);

2) число клітин;

3) сира і суха маса;

4) вміст білка і ДНК;

5) життєздатність клітин.

Для глибинного культивування рослинних клітин використовують закриті системи и періодичному або проточному режимах – способи культивування розроблені в мікробіології.

Суспензійні культури рослинних тканин широко використовують для отримання традиційних для рослин сполук вторинного синтезу: алкалоїдів, терпеноїдів, глікозидів, полісахаридів, ефірних олій, антиканцерогенів тощо.

ХІД РОБОТИ

1. Перенести шматочки калусної тканини в стерильну чашку Петрі.

2. Стерильним пінцетом подрібнити калус на фрагменти.

3. Фрагменти калусної тканини помістити у колби Ерленмейєра з рідким поживним середовищем (2-3 г / 100 мл).

4. Колби з рослинним матеріалом культивувати у темряві на шейкері (вібраторі) при 120 об./хв.

5. Через 10-14 днів середовище з клітинною суспензією профільтрувати через нейлон.

6. Фільтрат розділити на три порції, які розлити у стерильні колби Ерленмейєра.

7. До клітинної суспензії додати свіже середовище, довести об’єм до 100 мл.

8. Колби із суспензійною культурою помістити на шейкер.

9. Субкультивування клітинної суспензії проводити кожні 14-18 днів. Для цього у ламінар-боксі з колби з клітинною суспензією забрати 50-60 мл (≈2/3 об’єму) середовища з клітинами і замінити свіжим середовищем того ж складу. Відібране середовище перенести у стерильну колбу Ерленмейєра і свіжим середовищем довести об’єм до 100 мл.