ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 9

ІНДУКЦІЯ СТЕБЛОВОГО ОРГАНОГЕНЕЗУ В КУЛЬТУРІ КАЛУСНОЇ ТКАНИНИ КАРТОПЛІ

 

МЕТА: 

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ:  пробірки, колба з поживним середовищем для індукції стеблового органогенезу картоплі (дод. табл.10), стерильний довгий пінцет, стерильний матрацик, калус картоплі в пробірці або чашці Петрі, спиртівка, сірники.

 

Теоретична частина

 

Кінцевою метою всіх робіт з культури рослинних клітин і тканин, за винятком тих випадків, коли клітинна суспензія використо­вується для одержання вторинних метаболітів (речовин вторинного синтезу), є регенерація з калусних клітин цілої рослини. В основі регенерації лежить вторинна диференціація калусної клітини.

Завдяки властивості тотипотентності, притаманній рослинній клітині, з кожної калусної клітини (незалежно від того, з якого органу рослини був узятий експлант) може регенерувати ціла рослина. Проте ця потенціальна здатність реалізується далеко не завжди у різних рослин (до цього часу не вдається одержати рослини-регенеранти з однієї ізольованої клітини (протопласта) більшості хлібних злаків: пшениці, жита, кукурудзи та ін. (виняток складає рис), деяких бобових рослин).

Різні генотипи в межах будь-якого виду рослин можуть проявляти неоднакову регенераційну здатність. Тому вивчення механізму регенерації рослин з калусних клітин, оптимізація поживних середовищ і умов культивування для індукції морфогенезу є одним із найважливіших питань культури ізольованих клітин і тканин рослин.

Індукувати морфогенез у культурі калусної тканини можна з допо­могою зовнішніх і внутрішніх факторів: світла, температури, складу поживного середовища, і в першу чергу - зміни співвідношення фітогор­монів. Так, пересадка калусної тканини на середовище, в якому цитокініни переважають над ауксинами, призводить до регенерації пагона;  на середовищі з переважанням ауксинів індукується ризогінез (утворення кореневої системи).

Існують різні типи морфогенезу: соматичний ембріогенез і органоге-нез, який у свою чергу, підрозділяється на стебловий, кореневий і флоральний. При соматичному ембріогенезі з калусних тканин формуються біполярні зародкоподібні структури, в яких розвивається стебельце і корінець. У випадку стеблового органогенезу утворений пагін пересаджують на середо­вище з підвищеним вмістом ауксинів. Якщо ж морфогенез пішов за типом кореневого органогенезу, то одержати з коренів пагони не вдається.

Для індукції органогенезу у картоплі частинку калусної тканини, одержаної зі стеблового або листкового експланта стерильної рослини (2-ий і наступні пасажі), пересаджують на середовище з високим вмістом цитокінінів. Для вкорінення утворених пагонів їх пересаджують на середо­вище з підвищеним вмістом  ауксинів.

Індукція морфогенезу і регенерації рослин - складний, часто багато­ступеневий процес. У картоплі його можна підрозділити на декілька стадій:

1 - індукція зелених меристематичних зон;

2 - поява апексів;

3 - формування рослини-регенеранта;

4 - вкорінення регенеранта.

Чим молодша калусна культура (тобто чим менше часу пройшло з моменту її одержання), тим вища регенераційна здатність калусу. Склад середовища для індукції морфогенезу і регенерації рослин різних сортів картоплі може відрізнятися, але загальним правилом є підвищений вміст цитокінінів (зеатину або БАП). Склад середовища для індукції морфогенезу у рослин картоплі наведений у додатках (табл.11).

 

ХІД РОБОТИ

 

1. Стерильним пінцетом витягнути з пробірки (або чашки Петрі) калус конкретного сорту картоплі і покласти його на стерильний матрацик.

2. Стерильним скальпелем розділити калус на кусочки розміром  5 х 5 мм.

3. Стерильним пінцетом помістити кожен кусочок калусу в окрему пробірку із середовищем для індукції морфогенезу у картоплі.

4. Пробірку закрити корком і поставити у світлову кімнату з температурою 20-25оС, освітленістю 10 тис. люксів і вологістю 70%.

5. Через тиждень відзначити появу глобул, а через 3-5 тижнів – меристема­тичних зон яскраво-зеленого кольору.

6. Ще через 1-2 тижні відзначити появу апексів. Записати кількість апексів на кожному калусі.

7. Провести спостереження за тим, як апекси перетворюються в маленькі пагони (на одному експланті може появитися до декількох десятків пагонів).

8. Коли пагони досягнуть висоти 10 мм, зняти їх з калусу (з дотриманням усіх вимог асептики) і перенести на поживне середовище для вкорінення (дод. табл.12).

9. Відзначити (через 5-10 днів) появу коренів. Порівняти за морфогенною здатністю різні сорти картоплі; зробити відповідні висновки.

 

 

Робота захищена          балів.                 

 

 Підпис викладача                         

 

Контрольні запитання:

 

 

Доповнити роботою 10 стор. 44