ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 7

ВИДІЛЕННЯ І КУЛЬТИВУВАННЯ АПІКАЛЬНИХ МЕРИСТЕМ

СУНИЦІ. МІКРОКЛОНАЛЬНЕ РОЗМНОЖЕННЯ СУНИЦІ

МЕТА: оволодіти методиками виділення, культивування апікальних меристем та мікроклонального розмноження суниці.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: столони різних сортів суниці; пробірки зі стерильним модифікованим поживним середовищем М-С для культивування апікальних меристем суниці (дод. табл.15), стерильні чашки Петрі, стерильний скальпель, стерильна голка, бінокулярний мікроскоп МБ-9 або лупа, стерильне предметне скло, 96%-й спирт, стерилізуючі розчини (0,1% сулеми або 0,1 % діациду), марлеві мішечки, колба на 1 л із стерильною водою, стерильні хімічні стакани (4 шт.), спиртівка, сірники.

Теоретична частина

При культивуванні апікальних меристем суниці використовують поживне середовище з високим вмістом кінетину (0,5-1,0 мг/л). У результаті під дією високої концентрації кінетину проходить подавлення апікального домінування верхівкової меристеми і активація пазушних меристем. Приблизно через 2 тижні після поміщення на поживне середовище ізольованої верхівкової суниці, яка складається з меристематичного купола і 1-2 листкових примордіїв, основи листочків, що розгортаються, починають біліти. Згодом з пазух показуються пучки листків, які належать брунькам, що закладалися і проростали в пазухах. У пазухах цих нових листків знову закладуться бруньки і знову проростають. Через 1-2 місяці експланти перетворюються в конгломерат великої кількості різновікових і рівновеликих бруньок з розгорнутими листками. Утворені бруньки легко відокремлюються одна від одної і кожна, будучи пересадженою на свіже поживне середовище, продовжує формувати нові пазушні бруньки, збільшуючи тим самим число точок росту, але не утворюючи коренів. Для коренеутворення бруньки потрібно пересадити на поживне середовище, яке містить ауксин.

ХІД РОБОТИ

1. Ретельно промити столони суниці щіточкою в мильній воді і сполоснути чистою водою - спочатку водопровідною, а потім дистильованою.

2. Виділити скальпелем пазушні бруньки суниці, які розташовані біля основи листків. Цю операцію можна проводити поза ламінаром. Поза ламінаром на нестерильних бруньках слід також детально відпрацювати операцію вичленення апікальної меристеми суниці. Всю подальшу роботу необхідно поводити тільки в ламінарі.

3. Зібрати бруньки в марлевий мішечок і занурити його для стерилізації бруньок в 0,1 %-й розчин сулеми на 6-10 хв.

4. Вийняти мішечок за нитку із стерилізуючого розчину і 5-6 разів промити в стерильній дистильованій воді. Для цього достатньо мати два стакани, в кожний з яких налити на 1/4 об'єму стерильної води. Послідовно занурити в стакани мішечок з бруньками, прополіскуючи його у воді протягом декількох хвилин. Потім воду з другого стакана злити в перший, а в другий налити стерильної води з колби і знову прополіскувати в ній мішечок з бруньками. Процедуру повторити декілька разів.

5. Стерильні бруньки перенести з мішечка в стерильну чашку Петрі.

6. Для вичленення меристем бруньку суниці помістити на стерильне предметне скло і розглянути під бінокулярним мікроскопом (лупою) при 10-разовому збільшенні.

7. З допомогою стерильної препарувальної голки і стерильного скальпеля звільнити бруньку від численних листкових лусочок.

8. Притримуючи бруньку стерильною голкою, вичленити стерильним скальпелем (стерильною бритвочкою) меристематичний купол з 1-2 листковими примордіями. Для вправного виділення меристеми потрібні відповідні навики, тому дану технологію слід спочатку добре освоїти на нестерильних бруньках суниці.

9. Вичленену меристему перенести скальпелем у пробірку з поживним середовищем М-С, модифікованим для культивування апікальних меристем суниці (дод. табл. 15). Горловину пробірки після її відкривання і перед посадкою меристеми слід обпалити на спиртівці.

10. Обпалити на спиртівці ватний корок, повторно обпалити горловину пробірки і закрити її корком.

11. Помістити пробірки з апікальними меристемами суниці у світлову кімнату при температурі +25°С.

12. Через 4 тижні розглянути і замалювати конгломерат бруньок, який утворився в результаті росту апікальної меристеми суниці на поживному середовищі. Відмітити кількість утворених бруньок і порівняти за цією ознакою різні сорти суниці великоплідної.

13. Конгломерати бруньок використати для наступної лабораторної роботи з індукції коренеутворення при мікроклональному розмноженні суниці.

Робота захищена балів.

Підпис викладача

Контрольні запитання: