ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 6

МІКРОРОЗМНОЖЕННЯ КАРТОПЛІ ЖИВЦЮВАННЯМ ПАГОНІВ

МЕТА: Оволодіти методикою мікроклонального розмноження картоплі живцюванням пагонів.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: пробіркові рослини різних сортів картоплі; пробірки з модифікованим стерильним поживним середовищем для живцювання пагонів картоплі (дод. табл. 14); стерильні скальпелі, пінцети, чашки Петрі; 96%-й спирт у фарфоровому стаканчику; спиртівка; сірники.

Теоретична частина

Одним із найпоширеніших способів розмноження картоплі є живцювання стерильних рослин у пробірковій культурі. Для цього рослини виймають з пробірок, розрізують на частини, кожна ж яких містить живець - відрізок стебла з листком і пазушною брунькою. Живці пересаджують у пробірки з поживним середовищем Мурасиге-Скуга.

Розмноження живцями засноване на пригніченні апікального домінування і активації пазушних меристем при видаленні верхівки пагона. З пазушної бруньки живця при поміщенні його на поживне середовище розвивається пагін.

Кожне наступне живцювання у картоплі проводять через 14-21 день. З однієї рос-лини одержують 5-8 живців. За 2-3 місяці живцюванням можна одержати від однієї рос-лини 3-5 тис. рослин, а за 7 місяців можна досягти коефіцієнта розмноження 1 : 30-40 тисяч.

Після живцювання і одержання в умовах in vitro пробіркових рослин переходять до наступного етапу розмноження оздоровленого посадкового матеріалу. Розмноження проводять в умовах теплиці. Рослини з пробірок разом з агаровим поживним середовищем переносять в горщечки з ґрунтовою сумішшю, яка складається з торфокришки, дернової землі і піску у співвідношенні 3 : 1 : 1. Отвір у зволоженому в горщечку ґрунті роблять тупим кінцем пробірки незадовго до пересаджування. На 3-7-й день рослини підживлюють розчином Кнопа і мікроелементів за Мурасиге-Скугом: 5 мл маточного розчину мікроелементів у концентрації 1х100 розводять в 1 л води. Через 7-10 днів після приживлення рослин їх пересаджують на постійне місце в теплиці для одержання безвірусних бульб (міні-бульб), які в подальшому використовуються для посадки в полі.

Між тим, за прискореного розмноження картоплі живцюванням у пробірках слабкою ланкою залишається перехід від культури на стерильному поживному середовищі до вирощування в ґрунті. Коренева система, яка розвинулась у пробірці, майже повністю відмирає в ґрунті і утворюється нова, внаслідок чого рослини тривалий час перебувають у пригніченому стані і відстають у рості та розвитку.

Один із шляхів подолання цих труднощів - одержання бульб (мікро-бульб) на поживному середовищі в стерильній культурі. Цей процес може бути прискорений видаленням верхівок рослин, коливаннями температури і її зниженням - до +15^оС, слабкою освітленістю і коротким світловим днем. У ранніх і середньоранніх сортів бульбоутворення розпочинається через 1,5-2 місяці, у середньопізніх і пізніх сортів - через 2-2,5 місяці після посадки живця на середовище. Ріст мікробульб у пробірках добре поєднується з живцювання. Верхівка рослини відділяється і пересаджується на свіже середовище, потім зрізуються 2-3 верхівки з пазушних пагонів, які також використовують для подальшого розмноження. Таким чином, кожна рослина, призначена для одержання мікробульб, дає стільки ж живців, як і при живцюванні всього стебла в пробірці без утворення бульбочок.

При висаджуванні в ґрунт мікробульб з пробірок не потрібно спеціальних вегетаційних приміщень і укриття, рослини розвиваються швидше, частіше дають більший коефіцієнт розмноження, чим при висадці з пробірок. В даний час у картоплярстві використовують обидва способи розмноження оздоровленого вихідного матеріалу картоплі: пробірковими рослинами, і мікробульбами.

Схема мікроклонального розмноження і одержання оздоровленого вихідного матеріалу картоплі живцюванням рослин подана на рисунках 2. 3.

Рисунок 2. Схема одержання оздоровленого вихідного матеріалу картоплі за допомогою живцювання рослин. де: 1 - рослина, яка виросла з меристеми; 2 - діагностика на виявлення латентних вірусів; 3-4 - розмноження здорових клонів живцюванням у пробірках (декілька циклів); 5 -розмноження в закритому грунті, одержання 1-го бульбового покоління (міні-бульб); 6 - розсадник вихідного матеріалу в полі; 7 - розсадник клонів, масове розмноження.

-

А Б

Рисунок 3. Клональне мікророзмноження картоплі в умовах in vitro. де: А – рослина картоплі в пробірці на штучному поживному середовищі; Б – загальна схема живцювання пробіркових рослин картоплі на окремі частини – живці.

ХІД РОБОТИ

1. Підготувати до роботи ламінар – бокс, простерилізувати його бактерицидними лампами протягом 2 годин до початку роботи. Внутрішні стінки ламінара, робочий стіл, штатив з пробірковою культурою картоплі ретельно протерти спиртом. Робочі інструмен-ти простерилізувати спиртом і обпалити на спиртівці.

2. У ламінарі, в асептичних умовах ламінар-боксу вийняти стерильним пінцетом пробіркову рослину картоплі із пробірки.

3. Помістити рослину на стерильну чашку Петрі і гострим стерильним скальпелем розділити на живці. Живець - відрізок стебла з листком і пазушною брунькою. Частина стебла над листком при цьому повинна бути приблизно вдвоє коротшою від частини нижче листка (рис. 3). Необхідно дотримуватись строгої стерильності, і ріжучий інструмент після кожної операції розрізування потрібно дезінфікувати в спирті.

4. Живці перенести в пробірки на поживне середовище М-С для мікророзмноження картоплі живцюванням пагонів (склад поживного середовища для клонального мікророзмноження картоплі живцюванням пагонів подано у додатках, табл. 14). При перенесенні живця у пробірки нижню його частину занурюють у поживне середовище. При цьому листок із пазушною стебловою брунькою повинен знаходитися над поверх-нею штучного поживного середовища.

5. Обпалити горловину пробірки і обпалити ватний корок у полум'ї спиртівки для запобігання попадання в пробірку мікроорганізмів. Закрити пробірку корком.

6. Пробірку з живцем помістити у штатив (пінопластну або деревну палетку), замалювати загальний вигляд живців у пробірках у робочому зошиті, а потім поставити на стелажі світлової кімнати. Живці рекомендується вирощувати за температури +18-25°С, відносної вологості 70%, освітленості 6-10 тис. люкс при 16-годинному світловому періоді.

7. Через 7 і 14 днів провести візуальні спостереження за ростом і розвитком пагонів в умовах in vitro. Замалювати послідовні етапи розвитку рослин картоплі з живця.

8. Порівняти інтенсивність стеблоутворення в різних сортів картоплі; зробити відповідні висновки щодо регенеруючої здатності рослин залежно від фенотипічних особливостей сорту.

9. Пробірковий матеріал рекомендується використати для повторного клонального мікророзмноження картоплі живцюванням або для одержання мікробульб у культурі in vitro.

Робота захищена балів.

Підпис викладача

Контрольні запитання: