ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 4

ПАСАЖУВАННЯ КАЛУСНОЇ ТКАНИНИ НА СВІЖЕ

ПОЖИВНЕ СЕРЕДОВИЩЕ

МЕТА: навчитись методів пасажування тканин на свіже поживне середовище.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: культура калусної тканини різних рослин (моркви, тютюну, картоплі та ін.), пробірки зі стерильним агари-зованим середовищем, стерильний пінцет, стерильний скальпель, стерильні чашки Петрі, 96%-й спирт у фарфоровому стаканчику, спиртівка, сірники.

Теоретична частина

Основним типом культивованої рослинної клітини в умовах in vitro є калусна. Калусна клітина, у результаті поділу якої виникає калусна тканина або калус, являє собою один з типів клітинного дедиференціювання, притаманного вищій рослині. Калусна тканина - це аморфна маса тонкостінних паренхімних клітин, які не мають чітко визначеної анатомічної структури. Колір маси калусної тканини може бути білим, жовтуватим, зеленим, червонуватим, пігментованим повністю або зонально наявністю хлорофілу і антоціанів.

Залежно від походження і умов вирощування калусні тканини бувають:

1 - рихлими, сильно обезводненими, які легко розпадаються на окремі клітини;

2 - середньої щільності, з добре вираженими меристематичними зонами;

3 - щільними із зонами редукованого камбію і судин (в основному трахеїдоподіб-них елементів).

Як правило, у тривалій пересадочній культурі на середовищах, які включають ауксини, особливо синтетичний аналог ауксину - 2,4-дихлорфеноксиоцтову кислоту (2,4 Д), калусні тканини втрачають пігментацію і стають більш рихлими.

Калусні тканини (калус) мають важливе значення в клітинній інженерії, їх часто застосовують для збереження в ростучому стані колекцій різних штампів, ліній, мутантів; з них одержують суспензії клітин, які культивують у рідкому поживному середовищі. Як правило, для регенерації рослин надають перевагу також калусній тканині.

У циклі вирощування калусні тканини після низки поділів проходять звичайний для рослинної клітини онтогенез. Вони приступають до росту розтягуванням, потім диференціюються як зрілі калусні клітини і, нарешті деградують. Крива росту калусних тканин S-подібна (рис.1).

Рисунок 1. Модельна крива ростового циклу при періодичному вирощуванні калусних тканин і клітинних культур. де: Фази росту: 1 - латентна (лаг-фаза); 2 - логарифмічна; 3 - лінійна; 4 - сповільнення росту; 5 - стаціонарна; 6 - деградації і відмирання клітин,

Вона складається з наступних фаз: початкової латентної (лаг-фази); логарифмічного росту, під час якої відбувається активний поділ клітин; лінійної; сповільненого росту; стаціонарної; деградації і відмирання клітин.

Для того щоб зберегти здатність до поділу і подальшого росту, шматочок калусної тканини необхідно періодично переносити на свіже поживне середовище. Цей прийом підтримування клітинних поділів носить назву пасажування тканин. Періодичність пасажування у різних культур різна. Наприклад, пасажування (пересадка) калусу у картоплі проводиться (залежно від інтенсивносяі росту) через 3-6 тижнів. Переважно цикл вирощування калусу у цієї культури складає 4 тижні.

Пасажувати тканину можна необмежене число разів. Однак при багаторазовому його повторенні можливе "звикання", яке виражається в набутті автономності щодо гормонів і втраті або значному послабленні здатності калусних клітин до регенерації цілої рослини.

ХІД РОБОТИ

1. Взяти пробірки і чашки Петрі, в яких утворилися калусні тканини (картопля, морква, тютюн і т.д.), і перенести в ламінар.

2. Підготувати ламінар для роботи в асептичних умовах, внутрішні стінки протерти спиртом.

3. Перенести, дотримуючись строгої стерильності, калус із пробірок у стерильну чашку Петрі.

4. Стерильним скальпелем відділити від калусу старі некротизовані ділянки і шматочки прилиплого агаризованого середовища.

5. Потім стерильним скальпелем калусну тканину розділити на рівні кусочки у вигляді невеликих кубиків.

6. В ліву руку взяти пробірку зі свіжим поживним середовищем, правою - вийняти з неї пробку і горловину пробірки обпалити на спиртівці.

7. Вільними пальцями лівої руки припідняти кришку чашки Петрі, а правою рукою з допомогою стерильного пінцета перенести кубики калусної тканини в пробірку зі свіжим поживним середовищем, злегка втискаючи їх пінцетом в агар для кращого контакту із середовищем.

8. Після цього обпалити горловину пробірки, ватний корок і закрити пробірку корком.

9. Верхню частину пробірок обгорнути целофаном або парафілмом; на пробірці поставити дату пасажування і прізвище студента, який його проводив.

10. Пробірки помістити в термостат з температурою + 25^оС і вологістю 60 % на 3-4 тижні.

11. Через 3-4 тижні провести спостереження за ростом калусу і замалювати пробірки з калусною тканиною; зробити відповідні висновки.

Робота захищена балів.

Підпис викладача

Контрольні запитання: