ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 3
ОДЕРЖАННЯ І
КУЛЬТИВУВАННЯ КАЛУСУ ІЗ СТЕБЕЛ СТЕРИЛЬНИХ РОСЛИН КАРТОПЛІ
МЕТА: навчитись одержувати і
культивувати калусну тканину з рослин картоплі.
МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: стерильні рослини картоплі в пробірці (бажано
декілька сортів), стерильний пінцет, стерильний скальпель, стерильний матрацик
або чашка Петрі, спиртівка, 96%-й спирт у фарфоровому стаканчику, стерильне
поживне середовище для одержання і культивування калусу
картоплі (дод. табл. 8 і 9) у конічних колбах або пробірках, парафілм, ножиці, сірники.
Теоретична частина
В основі
культивування рослинних клітин лежить властивість тотипо-тентності,
завдяки якій соматичні клітини рослини здатні повністю реалізо-вувати
спадкову інформацію, тобто забезпечити розвиток всієї рослини, оскільки на
відміну від тваринної, рослинна клітина менш
вимоглива до умов культивування. У відповідь на поранення паренхімні клітини, поміще-ні на поживне середовище, яке містить фітогормони, дедиференціюються, переходять до поділу і утворюють калус (недиференційовану тканину). У картоплі калус може бути одержаний з тканин стебла, листка, бульби,
пилку. Калусна тканина - один з видів клітинного
поділу, яка виникає в результаті неорганізованої проліферації диференційованих
клітин органів рослини. Вона захищає
місце поранения, може накопичувати поживні речовини для анатомічної регенерації
або регенерації втраченого органу.
Процесу утворення калусу передує диференціація тканин експлана, в
результаті якої втрачається структура, характерна для перебігу специфічних
функцій в рослині, і повернення до стану клітин, що діляться. Якщо експлант є
фрагментом органу, то він в своєму
складі має епідермальні клітини, кліти-ни камбію,
судинної системи, серцевину і первинну паренхіму. Переважно діляться клітини
камбію та серцевинної паренхіми.
Різне походження тканин калусних
клітин є однією з причин гетероген-ності калусної тканини, оскільки деякі функціональні особливості початко-вих клітин передаються у ряді клітинних поколінь як
стійкі модифікації.
В біотехнології виділяють два типи
культивованих рослинних калусних клітин: нормальні і
пухлинні.
Нормальні
клітини в культурі можуть існувати: у вигляді суспензії
на рідкому пожиному середовищі і на поверхні твердого
поживного середовища у вигляді калусу. Поверхневе
культивування проводиться на напіврідкому агаризованому середовищі, на дисках з поліуретану, на містках з
фільтрувального паперу, напівзанурених в рідке
поживне середовище. Придатні для цих цілей і вата, оброблена поживним
середовищем, яка зверху покривається фільтрувальною бумагою, фольгою.
Пухлинні
клітини морфологічно мало відрізняються від калусних. Фізіологічною відмінністю є гормононезалежність
пухлинних клітин. Завдя-ки цій властивості вони
діляться і ростуть на поживних середовищах без фітогормонів та позбавлені здатності започаткувати нормально організовані
структури (коріння, пагони) в процесі органогенезу, іноді утворюють тера-томи (потворні органоподібні структури), подальший розвиток яких
неможливий.
Калусна тканина, що вирощується поверхневим способом, є аморфною масою
тонкостінних паренхімних клітин, що не має чіткої анатомічної структури. Колір
маси може бути білим, жовтуватим, зеленим, червоним. Залежно від походження і
умов вирощування калусні тканини бувають:
- рихлі, сильно обводнені, що легко розпадаються на окремі клітини;
- середньої щільності, з добре вираженими меристематичними осередка-ми;
- щільні, із зонами зредукованого камбію і
судин.
Ріст калусної
тканини, характеризується трьома типами клітин: дрібни-ми, середніми і
великими. При пасажуванні тканини на середовище, що
містить індуктори органогенезу, дрібні клітини діляться, формуючи мерис-тематичні вогнища, які започатковують утворення
бруньок з подальшим розвитком пагонів (геммогенез),
або до процесу ризогенезу.
Клітини меристеми ранніх стадій розвитку
відрізняються від калусних високим вмістом РНК і
білку. При культивуванні соматичних ембріоїдів калусна клітина середніх розмірів відособлюється,
обмежується щільною оболонкою, втрачаючи крупні вакуолі, містить велике
структуроване ядро з ядерцем. Клітина ділиться мітотично,
внаслідок чого виникають 2 клітини проембріо.
Наступне ділення клітин призводить до формування зародка, а також органу, аналогічного суспензорам в зародковому мішку сім'ябруньки.
Подальший розвиток соматичного ембріона через ряд стадій призводить до
регенерації цілої рослини з корінням і погонами, оскільки в цьому випадку формується
біполярна структура.
Калуси з високим морфогенетичним потенціалом
зазвичай матові, компактні, структуровані, мають зелені хлорофілвмісні ділянки, які є зонами
морфогенезу. Згодом там формуються пагони або раслини – регенеранти. У культурі зустрічаються і рихлі калуси, які не
мають глобулярного характеру. Такі калуси або
зовсім не здатні до органогенезу, або формують тільки коріння. Поява коріння
свідчить про зміщення гормонального балансу в бік ауксинів, що перешкоджає
утворенню пагонів. Ці калуси можуть
залишатися ризогенними, і регенерувати
з них рослини не вдається. Не морфогенні калуси можуть бути переведені в суспензійну культуру для отримання
вторинних метаболітів.
Перехід спеціалізованих клітин, що не
діляться, до проліферації пов'яза-ний з їх диференціацією (втратою спеціалізації). В
основі такого процесу, як і при диференціації клітин в рослині, лежить
диференціальна активність генів, які визначають структуру і функції клітин,
тобто спеціалізацію різних генів в різних клітинах.
Виникнення фізіологічних і структурних
відмінностей між клітинами і тканинами рослин, пов'язане з їх функціональною
спеціалізацією, називають процесом диференціації. Поняття
«диференціація» відображає перетворення ембріональної, меристематичної клітини
в спеціалізовану. Меристематичні клітини, однотипні по структурі і функції,
розвиваються різними шляхами, створюючи тканини різних органів. Між геномами в клітинах, які набувають різної форми і функції,
відсутні якісні відмінності, і ці клітини розрізняються тільки внаслідок різної
експресії генів. Новостворена клітина володіє широкими потенційними
можливостями і може розвиватися самостійно, як
морфологічно так і фізіологічно.
Визначення напрямку розвитку кожної клітини є основою фізіології
її розвитку і визначається особливим набором білків (кожна спеціалізована
клітина виробляє тільки їй властиві білки, що є наслідком диференціальної
активності генів - експресії однієї групи генів при одночасній репресії інших).
Здатність єдиної зрілої соматичної клітини дати початок цілому організму вказує
на те, що в процесі нормальної клітинної диференціації у рослин не відбувається
втрати або незворотньої інактивації генів.
У рослин майже всяка диференціація зворотня за умови, якщо диферен-ційована
клітина жива, в протопласті збереглося ядро і не утворилася вто-ринна оболонка.
За певних умовах багато зрілих рослинних клітин зберігає здатність
ділитися, а в деяких випадках і вступити на новий шлях розвитку.
Таким чином, після ділення перед кожною
дочірньою клітиною відкри-вається одна з трьох
варіантів: клітина може залишатися ембріональною і повторно вступати в
клітинний цикл з подальшим мітозом; може опинитися як би «поза циклом» (Go), переставши ділитися; поступово детермінуватися
та вступати на шлях диференціювання (спеціалізації).
Компетенція - здатність клітини сприймати індукуючу
дію і специфічно реагувати зміною розвитку. Індукуючу дію можуть створювати: гормони, продукти
життєдіяльності сусідніх клітин, інших тканин, електрофізіологічні сигнали.
Детермінація - набуття клітиною стану готовності до реалізації певних
спадкових властивостей. Вона може розпочатися відразу ж після ділення на
початку утворення протоплазми. Детермінована певним чином клітина набуває
вузької спеціалізації, тобто диференціюється і перетворюється на клітину
якої-небудь тканини. З гормональних факторів диференціації і морфогенезу клітин
першорядна роль відводиться ауксинам і цитокінінам.
Клітина, введена в культуру, зазнає послідовні
зміни: перехід до дифе-ренційованого стану, ембріонального росту
і, завдяки здатності калусу до вторинної
диференціації, формоутворення. Взаємодія між клітинами висту-пає
як вирішальний чинник їх диференціації і спеціалізації. Процес диферен-ціації клітин обумовлений різним ступенем репресії
і дерепресії генетичної інформації.
У асоціації клітин калусної тканини одні клітини займають певне положення і за допомогою
фізико-хімічних контактів впливають на інші, чим визначається їх структурно-функціональний стан.
Міжклітинні взаємодії відбуваються за допомогою відповідних донорно-акцепторних
молекул мем-брани цитоплазми, якими можуть бути
низькомолекулярні білки, комплекси вуглеводів з білками, фітогормони,
інгібітори, полярні з'єднання та інші. Але у всіх випадках на основі нуклеїново-білкового, білково-вуглеводного і іншого типу
функціонування вони сприятимуть злипанню або відштовхуванню клітин,
виступатимуть як ефектори або апорепресори.
У клітині реципі-єнта за допомогою спеціальних
рецепторів такі молекули зв'язуватимуться і змінюватимуть в епігенезі реакцію
генетичної інформації. Таким чином, в основі диференціації клітин лежать
процеси репрограмування, репресії, дерепресії генетичної інформації, які призводять до
утворення спеціалізова-них клітин, що стають здатними
до взаємодії, асоціації, утворення геомет-ричних
форм, до органо -і морфогенезу.
Мета даної
лабораторної роботи - одержати калус із стебла
стерильної рослини картоплі.
ХІД РОБОТИ
1. Ретельно
протерти ламінар зсередини спиртом.
2. Пробірку зі
стерильною рослиною картоплі протерти спиртом, горловину пробірки обпалити над
полум'ям спиртівки.
3. Стерильним
пінцетом (його тримати у лівій руці) витягнути стерильну рослину картоплі з
пробірки і покласти її на стерильний матрасик (або стерильну
чашку Петрі).
4. Підтримуючи
рослину пінцетом, вирізати стерильним скальпелем (його тримати в правій руці)
ділянки стебла довжиною 8-
5. Надсікти експланти стебла гострим стерильним скальпелем у декількох
місцях для появи в дальшому раневого калусу.
6. Нагріти
стерильне середовище на плитці до розплаву агару, а потім охолодити до 37 - 40оС
(приблизно температура визначається рукою: дно колби повинно бути теплим).
7. Відкрити колбу
із середовищем, обпалити її горловину над полум'ям спиртівки.
8. У стерильні
чашки Петрі, попередньо розгорнуті з крафт-паперу, розлити поживне середовище -
по 15-30 мл на кожну чашку (наливається приблизно або відмірюється стерильним
мірним циліндром).
9. Чашки тримати
відкритими мінімальний час. Після розливу пожив-ного середовища чашки закрити і
дати середовищу застигнути (це займе 10-15 хв.).
10. Надсічені експланти стебла картоплі стерильним пінцетом розміс-тити на поверхні агарового середовища, злегка
втискаючи їх пінцетом для посилення контакту з поживним середовищем. В одну
чашку поміщають 10-20 експлантів. Зробити посадку експлантів різних сортів картоплі.
11. Закрити чашку
Петрі і ретельно заклеїти її парафілмом у два шари. Парафілм слід натягувати рівномірно, щоб уникнути розривів
при його всиханні.
12. Поставити
чашки Петрі в термостат-кондиціонер без освітлення при температурі 22-25оС
і вологості 70%. Через 3 тижні
розглянути і замалювати утворені калуси.
Прослідкувати за особливістю калусоутворення у різних
сортів картоплі; зробити відповідні висновки.
Робота захищена
балів.
Підпис викладача
Контрольні запитання: Що лежить в основі культивування рослинних клітин? Що таке калусна
тканина? Назвіть типи культивованих
рослинних калусних клітин та охарактеризуйте їх. Дайте визначення поняттям диференціація, компетенція,
детермінація. Що лежить в основі
диференціації клітин?
