ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 2

Тема: МЕТОДИ СТЕРИЛІЗАЦІЇ ПІД ЧАС ПРОВЕДЕННЯ РОБІТ З КУЛЬТУРОЮ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН РОСЛИН

МЕТА: навчитись методів стерилізації під час роботи з культурою ізольованих клітин і тканин рослин.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: чашки Петрі (3 шт., одна з фільтрувальним папером), стакани хімічні на 300-500 мл (4 шт.), колба на 1 л з дистильованою водою, пробірки з поживним середовищем М-С без гормонів і з гормонами (2,4 Д - 2,0 мг/л, кінетин - 0,2 мг/л), скальпелі, пінцети, голки, марлеві мішечки (4 шт.), 1%-й розчин бікарбонату натрію, крафт-папір, шпагат, ножиці, папір фільтрувальний або інший для матрасиків, пральний порошок, хромпік, автоклав, сушильні шафи, фарфорові стакани (2 шт.), спиртівка, целофан, сірники.

Теоретична частина

Однією з основних умов успішного культивування ізольованих органів, тканин, клітин і протопластів є дотримання строгої стерильності, оскільки на штучних поживних середовищах, крім рослинних об'єктів, добре розвиваються і мікроорганізми, що становить подвійну небезпеку. По-перше, у результаті життєдіяльності мікроорганізмів може істотно змінитися склад поживних середовищ, по-друге, ізольовані від рослини тканини, клітини і особливо протопласти легко пошкоджуються мікроорганізмами. Тому всі досліди проводять у стерильних приміщеннях – бокса і ламінар-боксах. Сте-рилізують бокс, інструменти, посуд, рослинний матеріал, поживні сере-довища, ватні корки та всі інші матеріали, необхідні для роботи (табл. 2.1).

Таблиця 2.1. Методи стерилізації під час проведення робіт

в умовах in vitro

Прилади і об'єкт	Тривалість	Метод стерилізації	Примітка
Ламінар-бокс	2 год	Бактеріальними фільтрами Бактерицидними УФ лампами 70 %-м етиловим спиртом	Нагнітання повітря Опромінення. Протирання поверхні
Посуд	- - - 2 год 25-30 хв	Детергентами Хромпіком Дистильованою водою Сухим жаром - 160° Вологим жаром - 2 атм	Миття Миття Ополіскування Сушильна шафа Автоклав
Інструменти	2 год 1 год - -	Сухим жаром - 140° Кип'ятінням 96 %-м етиловим спиртом (ріжучі колючі) 96 %-м етиловим спиртом	Сушильна шафа У воді Протирання Обпалювання в полум'ї
Матеріали	25-30 хв	Вологим жаром - 2 атм (вата, марля, ватні корки, паперові матрасики, фільтрувальний папір, халати, косинки)	Автоклав
Рослинний матеріал	Залежно від виду рослин ного об'єкта і стерилізуючо го розчину	0,1 %-ю сулемою, 0,1 %-м диацидом 13-20% перекисом водню, 3-6% хлораміном 10%-м гіпохлоратом Na, Ca Стерильна вода	Прополіскування декілька разів
Поживне середовище	20 хв	Вологим жаром – 120^о, 1 атм	Автоклав
Холодна стерилізація	-	Стерильні дрібнопористі бактеріальні фільтри, з Ø пор 0,45 мкм Звільнення від бактерій	Органічні сполуки, які не витримують нагрівання (напр. ферменти)

Стерилізація ламінар-боксу. Ламінар-бокси призначені для культури ізольованих клітин, тканин і деяких інших робіт, які вимагають стерильності. Стерильність забезпечується з допомогою бактеріальних фільтрів, вста-новлених у ламінар-боксі, через які нагнітається повітря. За 2 год до початку роботи ламінар-бокс опромінюють (насвічують) бактерицидними ультрафіолетовими лампами. Попередньо до цього в ламінарі переносять спиртівку, сірники, фарфоровий стакан з 96%-м спиртом і стакан із

стерильною водою. Розміщують також стерильний посуд та інструменти, необхідні для роботи. При вичлененні апікальної меристеми (картоплі, великоплідної суниці) у ламінарі розміщують бінокулярну лупу. Перед початком роботи необхідно ретельно вимити руки з милом і протерти їх спиртом, одягти стерильний халат, зав'язати волосся стерильною марлевою косинкою або одягти стерильну шапочку. Розпочинати роботу слід з ретельного протирання внутрішньої поверхні ламінару, спиртівки, пробірок з поживним середовищем 70%-м спиртом.

Стерилізація посуду. Спочатку посуд ретельно миють з використанням детергентів (різні мийні засоби, пральні порошки), а також розчину двохромовокислого калію в сірчаній кислоті (хромпік). Вимитий посуд обполіскують декілька разів дистильованою водою і висушують у сушильній шафі. Щоб уникнути зараження простерилізованих предметів з повітря, перед стерилізацією їх загортають в обгортковий папір, при цьому у стаканів і колб достатньо обгорнути тільки горловину.

Потім посуд переносять у сушильну шафу і прогрівають при температурі + 160^оС протягом 2 год. (з моменту встановлення необхідної температури). При такому нагріванні гинуть не тільки бактерії, але й їх спори.

Температура вище 175°С недопустима, оскільки при цьому ватні корки буріють, а паперова обгортка стає ламкою.

Більш строгої стерилізації можна добитися під тиском в автоклаві, оскільки вологий жар більш пагубний для мікроорганізмів і спор. Посуд (стакани з кришками, чашки Петрі, піпетки) загортають у фольгу або обгортковий папір, зверху в целофан. При автоклавуванні градуйованих піпеток верхню частину їх загортають ватою і кожну загортають у папір окремо. Автоклавують під тиском 2 атм протягом 25-30 хвилин.

Стерилізація інструментів. Попередня стерилізація інструментів (скальпелів, пінцетів, голок і т.д.) полягає в нагріванні сухим жаром у сушильній шафі протягом 2 год. при 140^оС. Шприци, ножиці, скальпелі зручніше кип'ятити. Металічні предмети не можна автоклавувати: під дією пари вони вкриваються іржею і затуплюються. Безпосередньо перед і в процесі роботи інструменти ще раз стерилізують в ламінарі, поміщуючи їх у фарфоровий стакан з 96 %-м етиловим спиртом і обпалюючи в полум'ї спиртівки. Після стерилізації обпалюванням кожний інструмент поміщають між листками попередньо простерилізованого паперу, складеного в пачку. Стерильний інструмент використовують тільки для одноразової маніпу-ляції. Перед повторним вживанням його слід простерилізувати спиртом і обпалити. Дуже тонкі інструменти (голки, кусочки бритвочок скальпелі) можуть втрачати свої властивості при обпалюванні, тому їх стерилізують, занурюючи в спирт.

Стерилізація матеріалів. Вату, марлю, ватні корки, паперові матрасики, фільтрувальний папір, халати, косинки, шапочки стерилізують в автоклаві під тиском 2 атм протягом 25-30 хвилин.

Стерилізація рослинного матеріалу. Для стерилізації насіння, верхів-кових меристем, кусочків тканини, виділених із різних частин рослини, застосовують наступні розчини: 0,1%-ї сулеми (двохлориста ртуть), 0,1%-го діациду, 13-20%-го пергідролю, 3-6%-го хлораміну, 10%-го гіпохлориту натрію або кальцію.

Діацид готують, розчинюючи окремо 330 мг етанолмеркурхлориду і 660 мг ацетилпіридинію хлориду в гарячій воді (приблизно 300 мл), потім їх змішують і доводять об'єм рідини до 1 л, додають декілька крапель детергенту твін-80; зберігають у щільно закритій колбі в темноті.

Перед стерилізацією тканину рослини попередньо очищують. Коре-неплоди, бульби, товсті стебла рослин ретельно миють щіточкою з милом у теплій проточній воді, знімають шкірку (у коренів і коренеплодів), кору (у листків), промивають дистильованою водою і опускають на декілька секунд (насіння - на 1-2 хв.) в 70%-й етиловий спирт. Обробка тканин етанолом підвищує ефект основного стерилізуючого розчину. Потім рослинні об'єкти багаторазово прополіскують у стерильній воді. Більш детально особливості предстерилізації, стерилізації і постстерилізації різних частин і органів рослини подано у додатках (табл. 6 і 7).

Пергідроль рекомендується використовувати для квасолі, соняшника (з очищеною шкіркою), сулему - для томатів, гарбузів та ін. Тривалість стерилізації різних об'єктів подана у таблиці 3.

Таблиця 3. Стерилізація різних видів вихідного рослинного матеріалу

Об’єкти	Тривалість стерилізації, хв.
	Діацид 0,1 %	сулема 0,1 %	гіпохлорати Са, 10 %	Н2О2 13-20 %
Насіння сухе	15-20	10-15	15-20	12-15
Насіння набухле	6-10	6-8	10-15	6-8
Тканини м'ясистих коренів, бульб	20-30	15-25	15-20	-
Тканини стебла	20-40	20-25	20-25	-
Листки	1-3	0,5-3	3-6	3-5
Апекси	1-10	0,5 -7	3-15	2-7

Після обробки рослинних об'єктів стерилізуючими розчинами (згідно з прийнятими експозиціями), їх залишки видаляються прополіскуванням у стерильній воді. Найлегше відмивається пергідроль. Після сулеми і діациду воду міняють 5-6 разів.

Насіння помідорів, яблуні, гарбузів, бобів, тютюну до часу дозрівання знаходиться в м'ясистих, дерев'янистих або кістянкоподібних покривах. Тому здорові, з непошкодженою поверхнею плоди цих культур достатньо ретельно промити мильною водою, потім декілька разів спиртом, після чого в строго асептичних умовах їх розрізують. Стерильним пінцетом виймають насіння і поміщують його в стерильні чашки Петрі для пророщування (на фільтрувальному папері, ваті).

Стерилізація поживних середовищ. Розлиті в пробірки поживні сере-довища закривають ватними корками, загортають у целофан і автоклавують за температури 120⁰С і тиску 1 атм. протягом 20 хвилин.

Середовище, яке не містить термолабільних речовин, стерилізується автоклавуванням при тиску 1 атм. за об’єму середовища 25-50 мл – протя-гом 20 хвилин, 1-2 л середовища – протягом 30-40 хвилин. Для стерилізації розчинів з термолабільними речовинами (вітаміни, антибіотики, амінокислоти, рослинні екстракти, абсцизова кислота), які руйнуються під час автоклавування, використовують бактеріальні фільтри. У цьому випадку стерилізацію проводять у стерильному боксі.

Невеликі об’єми середовища можна стерилізувати, використовуючи побутову скороварку. Термостійкий посуд із середовищем ставлять на решітку, розташовану на дні каструлі і покриту тканиною. Час стерилізації 15-20 хвилин, після чого скороварка повинна помалу остигнути до нормального тиску. Потім в умовах стерильного боксу неостуджене середовище розливають у культуральний посуд.

Зберігати готові середовища рекомендують при 10^оС. При кімнатній температурі інфекція на середовищі зявляється через 5-10 днів, тому, якщо немає впевненості у стерильності приготованого середовища, окремий культуральний посуд з середовищем повинен підлягати контролю.

Холодна стерилізація. Органічні рідини, які не витримують нагрівання, звільнюються від бактерій пропусканням через стерильні дрібнопористі бактеріальні фільтри з діаметром пор 0,45 мкм.

ХІД РОБОТИ

1. Простерилізувати інструменти, посуд і поживні середовища, які необхідні для проведення робіт з вирощування стерильних паростків і одержання калусних тканин.

2. Загорнути в щільний папір і простерилізувати сухим жаром у сушильній шафі протягом 2 год. при температурі + 160°С наступний посуд: чашки Петрі, хімічні стакани на 300-500 мл (по 2 шт. на робочу бригаду студентів з 4 чол.).

3. Піддати попередній стерилізації в сушильній шафі скальпелі і пінцети. Перед поміщенням у сушильну шафу інструменти загорнути в щільний папір.

4. Простерилізувати в автоклаві паперові матрасики і дистильовану воду в колбі. Матрасики загорнути в щільний папір, а зверху - у целофан. Для одержання стерильної води в колбу налити 1/3 об'єму дистильованої води, закрити ватним корком, зверху щільним папером і целофаном. Автокла-вувати матеріали при тиску 2 атмосфери. протягом 30 хвилин.

5. Простерилізувати в автоклаві пробірки з поживним середовищем, закриті ватними корками. Перед автоклавуванням пробірки із середовищем загорнути по 10-20 штук. у целофан або обгортковий папір і автоклавувати при тиску 1 атмосфер протягом 20 хвилин. Одночасно в автоклаві слід простерилізувати марлеві мішечки для рослинного матеріалу. Перед поміщенням в автоклав мішечки загорнути в целофан або обгортковий папір.

Робота захищена балів.

Підпис викладача

Контрольні запитання: Для чого стерилізується лабораторне обладнання та необхіні предмети задіяні на культивування клітин, протопластів? Які основні стерилізуючі речовини використовують при проведенні стерилізації? Які існують методи сиерилізації при проведенні культивування клітин та протопластів? Від чого залежить тривалість стерилізації рослинного матеріалу? Розкажіть суть стерилізації поживних середовищ.