ЛАБОРАТОРНА РОБОТА 1.

Тема: ПРИГОТУВАННЯ ПОЖИВНИХ СЕРЕДОВИЩ ДЛЯ КУЛЬТИВУВАННЯ ІЗОЛЬОВАНИХ КЛІТИН І ТКАНИН РОСЛИН

МЕТА: навчитись готувати поживні середовища для культивування ізольованих клітин і тканин рослин.

МАТЕРІАЛИ І УСТАТКУВАННЯ: стакани хімічні на 1 л (4 шт.), колби з притертими корками для зберігання маточних розчинів (на 1 л - 3 шт., на 100 мл - 1 шт.), пляшечки з-під пеніциліну (10 шт.), мірні піпетки на 10, 5 і 1 мл, вага технічна, вага електронна торзійна або аналітична, електроплитка, набір хімічних реактивів (дод. табл. 1), сахароза, агар-агар, ватні корки.

Теоретична частина

За всю історію розвитку мікроклонального розмноження запропоновано багато видів компонентів для приготування поживних середовищ: Мурасіге-Скуга, Андерсона, Джемборга В5, середовище для деревинних культур Woody Plant Vedium, WPM. Всі вони різняться видом і співвідношенням компонентів (їх склад подано у додатках 1, 2, 3).

В промислових біолабораторіях рекомендовано і найбільш широко використовуються середовища Мурасіге - Скуга (МS), яке стало стандартом для розмноження трав'янистих рослин. На його основі модифіковані поживні середовища для продукування картоплі (модифікація інституту картопляр-ства, суниці – інституту садівництва та інші).

Основні складові поживного середовища поділяють на три класи: неорганічні солі; органічні речовини; природні компоненти речовин.

Сполуки, необхідні для успішного росту клітин in vitro та регенерації, поділяють на пять класів: неорганічні макро –та мікроелементи; джерела вуглецю та енергії; вітаміни; відновлений азот; фітогормони.

До складу всіх живильних середовищ входять:

Макросолі представлені азотом, фосфором, сіркою та залізом.

Азот у складі більшості поживних середовищ представлений у вигляді нітрату і лише в деяких середовищах (Мурасіге і Скуга, Гамборга та ін.), крім нітратів, додають солі амонію. Нітрати, як основне джерело азоту, вводяться в середовище в концентрації від 2 до 25 мМ. У деяких випадках для інтенсивного росту калусних та суспензійних культур сумарну концентрацію нітрату і аміаку можна збільшити до 60 мМ. Існує чітка кореляція між збільшенням сирої маси суспензії клітин рослин і використанням нітратів із середовища, що свідчить про значне перетворення нітратів в органічні сполуки. Встановлено, що в клітинній суспензії тютюну Nicotiana tabacum присутня активна, залежна від енергії, система надходження нітратів у клітини. Вона індукується нітратом і пригнічується амінокислотами. Заміна 10-20% нітратів на солі амонію сприяє кращому росту тканини.

Фосфор є необхідним компонентом росту калусних тканин та ізольованих органів, який вводиться в склад поживного середовища у вигляді ортофосфату. Крім цього, джерелом фосфорного живлення можуть бути фосфати цукрів. Іони Na^+, Сl^-, S0₄^2- необхідні для культивування тканин у невеликих кількостях і які важливі при регулюванні рН середовища.

Сірку вводять до складу поживного середовища у вигляді сульфату, сульфіту, цистеїну, глутатіону або метіоніну.

Залізо вводиться у вигляді неорганічних солей (FеСІ₂, Fе₂(S0₄)₃ і солей органічних кислот (лимоннокисле залізо). Доцільним є введення хелатуючих реагентів, таких як етилендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), яка покращує засвоєння заліза при широкому діапазоні рН.

Крім основних макроелементів, до складу більшості середовищ вводять мікроелементи (цинк, бор, молібден, марганець та інші). Їх введення у поживне середовище неминуче, оскільки солі макроелементів, які викорис-товуються, не завжди їх містять.

Вуглеводи є не замінимими компонентами поживних середовищ для культивування ізольованих клітин і тканин, тому що в більшості випадків не придатні до автотрофного живлення. Найчастіше як джерело вуглеводів використовують сахарозу або глюкозу в концентраціях 2 - 4% (20 - 40 г/л), або звичайний цукор. Поліцукри, як правило, не використовують як джерело вуглецевого живлення; але оскільки деякі тканини, наприклад пухлинні, містять активні гідролітичні ферменти (амілаза та ін.), вони можуть рости на середовищах з розчиненим крохмалем.

Вітаміни. Їх вплив на розвиток тканин при мікроклональному розмноженні вивчена недостатньо, проте більшість вітамінів, що входять до складу поживних середовищ при певних концентраціях стимулюють процеси росту і розвитку клітин та інші важливі реакції. Зокрема, тіамін (вітамін В₁) входить до складу піруватдекарбоксилази і відіграє важливу роль у перетворенні вуглеводів, а також в окислювальному декарбоксилюванні кетокислот. До складу поживних середовищ тіамін вводиться в кількості 0,1-10 мг/л, а в окремі і піридоксин (вітамін В₆), який бере участь в процесах декарбоксилювання та переамінування амінокислот. Нікотинова кислота у вигляді аміду входить до складу окислювально-відновних ферментів - дегідрогеназ. В поживні середовища нікотинова кислота вводиться в концентрації 0,5-1 мг/л. Можливе використання піродоксину, іноситолу, пантотеїнової кислоти (0,1 мг/л), біотину (0,1 мг/л).

Для росту і диференціації будь-яких рослинних клітин необхідні регулятори росту (ауксини та цитокініни). Оскільки різні клітини і тканини в культурі значно відрізняються за здатністю до автономного синтезу та метаболізму окремих фітогормонів, тому їх ріст в значній мірі залежить від присутності екзогенних регуляторів росту. Відмінності у потребі в екзоген-них ауксинах та цитокінінах дозволяють виділити декілька груп тканин:

- тканини, які ростуть на середовищі з ауксинами (експланти топінам-бура, корені цикорію);

- тканин, для росту яких потрібні тільки цитокініни (культура кінчика корінця білого турнепса);

- тканини, для росту яких необхідні ауксини і цитокініни (культивовані первинні експланти тютюну, тканини кореня моркви);

- тканини, які ростуть на середовищах складного складу;

- культури тканин - пухлин, що здатні рости на середовищах без регу-ляторів росту.

Для отримання і підтримання культур тканин використовують: ауксини (індолілоцтову кислоту (ІОК) в концентрації 1 - 30мг/л, а-нафтилоцтову кислоту (НОК) в концентрації 0,1 - 0,2мг/л та 2,4 - дихлорфеноксиоцтову кислоту (2,4-Д) в концентрації меншій, ніж 1мг/л). Для індукції утворення калусу, як правило, використовують вищі концентрації ауксинів, а при наступних пересадках тканина може рости при зменшеному у 10 разів вмісті ауксинів. Для росту клітин і органів рослин в культурі in vitro як цитокініни використовують: кінетин (Кін), 6-бензиламінопурин (БАП) та. ін. Змінюючи склад фітогормонів можна регулювати утворення коренів, листків, квіток, пагонів або зародків, з яких розвинеться рослина. При додаванні фітогор-монів відбувається ріст різноманітних меристем. Клітини меристем відріз-няються від клітин калусу меншим розміром і бльшим ядром та щільшішою цитоплазмою. При більшому вмісті ауксинів – розвиваються кореневі меристеми, цитокінінів – утворюються стеблові пагони та бруньки.

Фітогормони (регулятори росту) це фундаментальна основа при маніпу-ляціях з тканинами рослин при їх розмноженні, забезпечуючи природний баланс гормонів рослини і стимулює ті чи інші фізіологічні зміни в її рості і розвитку. До них належать ауксини, цитокініни та гібереліни. Ауксин та цитокінін є стабільними сполуками і їх можна стерилізувати автоклавуван-ням, гібереліни - нестабільні і при стерилізації інактивуються. Тому для одержання калусних тканин в склад поживних середовищ обов'язково входять ауксини, які викликають клітинне дедиференціювання і цитокініни, які індукують поділ дедиференційованих клітин. Для індукції стеблового морфогенезу вміст ауксинів може бути знижений або вони можуть бути повністю виключені. На середовищах без гормонів ростуть пухлинні і "привиклі" тканини. Автономність по відношенню до двох або одного гормону пов'язана із здатністю цих клітин продукувати гормони.

Стимулювання галуження експланта можливо досягти шляхом збіль-шення концентрації цитокініну в поживному середовищі. Цитокінін - це природний регулятор росту рослини (гормон), який регулює кількість та інтенсивність росту бічних пагонів в рослині. Додавання штучно синтезованого цитокініну: кінетин, зеатин, N⁶ - бензиладенін (ВА), N⁶ - ізопентиладенін до поживного середовища є передумовою успішного галуження експланта в процесах, які його вимагають. Робоча концентрація цитокініну від 0,01 до 10,0 мг/л, оптимальна - 0,1 - 5,0 мг/л, яка використовується в більшості середовищ, що застосовуються при промисловому мікророзмноженні.

Механізм дії цитокініну полягає в пригніченні росту термінальної (апікальної) точки росту пагона і стимулюванні росту латеральних бруньок, що призводить до утворення численних пагонів, що і є метою і головним завданням розмноження рослин в культурі тканин.

Заключним етапом мікророзмноження є вкорінення отриманих пагонів. Стимулювати цей процес можливо за допомогою гормонів - ауксинів, котрі активізують апікальний ріст рослини і утворення коренів. Для досягнення такого ефекту до середовища вводять синтетично синтезовані ауксини: індоліл - 3 - оцтову кислоту (ІАА), індоліл - 3 - масляну кислоту (ІВА), a-нафтилоцтову кислоту (КАА) в концентрації 0,1-10 мг/л. Практикується застосовування 2,4 - D (2,4 дихлорофеніксиоцтову кислоту) в концентрації 40-120 мг/л. Найбільш часто застосовують 2,4 Д, тому що ІОК майже в 30 разів менш активна, ніж 2,4 Д. Для індукції калусу необхідні високі концентрації ауксинів (частіше 2,4 Д), при наступних пересадках (пасажуванні) їх зменшують. Як джерело цитокінінів в штучних поживних середовищах використовують кінетин, 6-бензиламінопурин (6 - БАП), зеатин (0,001 - 10,0 мг/л). 6 - БАП і зеатин у порівнянні з кінетином більш активні по відношенню підтримки росту ізольованих тканин і індукції органогенезу. В склад деяких поживних середовищ входить аденін.

Гібереліни - гіберелінова кислота не є основним компонентом поживних середовищ, проте може використовуватися для активізації (витягування) росту пагонів в довжину у культур, в яких повільно ростуть пагони.

Регулятори росту повинні зберігатися в холодильнику при низькій температурі (біля 0°С), де вони з часом втрачають активність. Всі гормони розчиняються в органічних розчинниках, об'єм яких не більше 0,5% від кінцевого об'єму приготовленого середовища. Цитокініни є слабкими лугами і можуть бути розчинені в розчинених кислотах з послідуючим розбавленням у воді до необхідного об'єму. Ауксини є слабкими кислотами і можуть бути розчиненими у розчині слабкого лугу або спирту. На практиці викорис-товують 0,3 мл 1н НСl для розчинення цитокініну або NаОН для ауксину на кожні 10 мг гормону (табл. 4.2.1).

Таблиця 4.2.1. Роль фітогормонів в процесах росту і розвитку рослин

Ауксини	Цитокініни	Гібериліни
Ріст стебла
Сприяють збільшенню розмі-рів клітин нижче за точку рос-ту. Сприяють поділу клітин камбію.	Стимулюють поділ клітин в апікальній меристемі і камбію. Іноді інгібують фазу розтягу клітин.	Сприяють збільшенню клітин у присутності ауксинів. Крім того, сприяють поділу клітин апікальної меристеми і камбію У деяких розеткових рослин сприяють «виходу в стрілку»
Ріст кореня
При дуже низьких концентра-ціях стимулюють. При більш високих пригнічують (геотро-пізм)	Неактивні або сти-мулюють ріст пер-винних коренів	Неактивні
Ініціація росту коренів
Сприяють формуванню коренів на живцях і калусах	Неактивні, чи спри-яють росту бічних коренів	Інгібують
Ініціація утворення бруньок (пагонів)
Діють як антагоністи цитокі-нінів, однак іноді при знятті апікального домінування сти-мулюють ріст пагонів	Стимулюють	При знятті апікального домі-нування стимулюють ріст па-гонів
Ріст листків
Неактивні	Стимулюють	Стимулюють
Ріст плодів
Стимулюють, іноді виклика-ють партенокарпію	Стимулюють, іноді викликають парте-нокарпію	Стимулюють, іноді викликають партенокарпію
Домінування верхівки
Посилюють, тим самим приг-нічуючи ріст бічних бруньок	Антагоністи аукси-нів, стимулюють ріст бічних бруньок	Посилюють ріст ауксинів
Стан спокою в бруньках
Неактивні	Порушують	Порушують
Стан спокою в насінні
Неактивні	Порушують	Порушують
Цвітіння
Як правило, неактивні	Як правило, неактивні	У рослин довгого дня стиму-люють. У рослин короткого дня сповільнюють
Старіння листків
У деяких рослин сповільню-ють	Сповільнюють	У деяких рослин сповільнюють
Опадання плодів
Сповільнюють (в окремих випадках стимулюють)	Неактивні	Неактивні
Вплив на продихи
Неактивні	Сприяють відкриванню	Неактивні

Інші складові. Результатами наукових досліджень доведено позитивний вплив на тканини гідролізату (витяжки) протеїну з казеїну (30-3000 мг/л), що є джерелом органічного азоту і амінокислот. Кокосове молоко (10-20% ), мальтоза (500 мг/л), екстракт дріжджів (50-5000 мг/л), томатний сік (30%), апельсиновий сік (30%), бананове пюре, лимонна кислота (150 мг/л), аскорбінова кислота (10 мг/л), які використовуються як антиоксиданти для запобігання коричневіння тканин. Всі ці компоненти можуть додаватися до середовищ під час їх приготування, проте не можуть автоклавуватися оскільки стерилізація проводиться шляхом фільтрування через нанофільтри

Для вирощування в культурі тканин окремих видів рослин до середовищ приготовлених на основі агару додають активоване вугілля, особливо на ста-дії 3 - укоріненні експлантів. Активоване вугілля додається в концентраціях 0,1-3%, позивний вплив якого виражається у:

- стимуляції розвитку коренів (3 стадія розмноження), оскільки вважа-ється, що наявність в середовищі активованого вугілля надає йому темного забарвлення і світло не так інтенсивно проникає до зони утворення коренів - в темноті вони утворюються активніше;

- запобіганні утворення не бажаного розвитку калусу в точках росту культури;

- адсорбції з середовища і самої рослини сполук, що пригнічують ріст і розвиток культури;

Застосування активованого вугілля має і свої недоліки - темне забарв-лення середовища значно ускладнює виявлення розвитку патогенної флори (грибів і бактерій), тому необхідно більш ретельно проводити інспекції - браковки. При експорті рослин в культурі тканин заборонено застосовувати середовища з додаванням активованого вугілля, оскільки карантинні служби не в стані ідентифікувати наявність розвитку патогенних організмів. Застосування в середовищі активованого вугілля завжди послаблює дію гормонів. Для індукції первинного калусу і рідше для підтримки його росту до поживного середовища іноді додають рослинні екстракти або соки. Найбільшу здатність активізовувати ріст має кокосове молоко - рідкий ендосперм кокосового горіху

Для приготування твердих поживних середовищ використовують агар-агар. Це полісахарид, який одержують з морських водоростей. Агар-агар попередньо добре промивають від різних домішок. Найменшу кількість небажаних домішок містить бактеріальний агар зарубіжного виробництва “Bacto-Agar” (фірма США). Такий агар можна використовувати для приго-тування поживних середовищ без попереднього промивання. Переважно для одержання твердого поживного середовища до нього додають 0,3-0,7% агару.

З метою економії часу розчини макросолей, мікросолей, вітамінів і фітогормонів готують концентрованими, що дозволяє багаторазово їх використовувати. Концентрація розчинів макросолей повинна бути більшою в 10-20 разів, мікросолей - 100-1000 разів, вітамінів - у 1000 разів. Кон-центровані (маточні) розчини зберігають у холодильнику, причому вітаміни потрібно зберігати при мінусовій температурі (у морозильній камері).

Реакція середовища - є визначальним показником придатності середо-вища для росту рослин і агрегатного стану самого середовища, оскільки рослини добре розвиваються при рН 5,5, при більш кислій реакції середови-ще буде залишатися в рідкому стані оскільки агар в таких умовах не актив-ний. Корекцію рН проводять шляхом додавання 1н НС1 або 1н NаОН до необхідного значення.

Розчинник. Універсальним розчинником для приготування середовищ є дистильована вода.

Готові середовища. В більшості країн доступними через спеціалізовану мережу є готові сухі суміші для приготування поживних середовищ, для використання вони вимагають лише розчинення у дистильованій воді.

Для культивування клітин, тканин і органів тих чи інших рослин використовують живильні середовища різного складу. Найбільш широко використовуються середовища Мурасиге-Скуга (М–С), Уайта, Гамборга (В₅). Склад цих середовищ подано у додатках (табл. 1, 2, 3).

ХІД РОБОТИ

Приготувати поживне середовище Мурасиге-Скуга (М–С), яке буде використовуватися для виконання наступних лабораторних робіт, склад якого наведений в додатках. Спочатку слід приготувати маточні (концентровані) розчини макросолей, мікросолей івітамінів, а після цього – робоче поживне середовище. Кількість солей, необхідних для приготування маточних розчинів поживного середовища М-С, а також кількість маточного розчину, яку необхідно взяти для приготування робочого поживного середовища (табл. 1).

Таблиця 1. Розрахунки для приготування маточних розчинів поживного

середовища Мурасиге - Скуга

Компонент	Наважка, г	Температура зберігання	Кількість маточного роз-чину для приготування 1л середовища, мл
Макросолі, г на 1 л маточного розчину
KNO3	38	4^оС	50
NH4 NO3	33
KH2PO4	3,4
MgSO4·7H2O або	7,4
MgSO4 безводний	3,6
CaCl2·2H2O або	13,8	4^оС	5
CaCl2 безводний	8,8
Fe – хелат, мг на 100 мл маточного розчину
Fe2SO4 · 7H2O	557	4^оС	5
Na2 ЕДТА · 2Н2О	745
Мікросолі, мг на 100 мл маточного розчину
H3BO3	620	4^оС	1
MnSO4 · 4H2O	2230
ZnSO4 · 7H2O	860
KJ	83
Na2MoО4 2H2O	25
CoCl2 · 6H2O	2,5
CuSO4 · 5H2O	2,5
Органічні компоненти, мг на 10 мл маточного розчину
Мезоінозит	1000	- 20^оС	по 1 мл
Нікотинова кислота	5
Піридоксин HCl	5
Тіамін HCl	5
Гліцин	20
Сахароза	-	кімнатна	30 г/л
Агар	-	кімнатна	7 г/л

Послідовність приготування маточних розчинів макро-, мікросолей і вітамінів:

Виготовити згідно з прописом розчин NH₄NO₃, KNO₃, KH₂PO₄, MgSO₄·7H₂O. Кожну сіль розчинити в окремому хімічному стакані при нагріванні (крім MgSO₄·7H₂O), а потім злити разом і об'єм довести до 1л. Розчин MgSO₄·7H₂O вливають останнім без нагрівання, причому в охолоджену суміш, що попереджує випадання осаду.

2. Виготовити згідно з прописом розчин CaCl₂.

3. Виготовити згідно з прописом розчин хелату заліза (розчин FeSO₄ і Na₂ЕДТА), який потрібний для утворення хелату заліза, слід нагріти до кипіння).

4. Виготовити згідно з прописом розчин мікроелементів.

5. Одержані розчини макро -і мікроелементів злити окремо в скляні посудини з притертою пробкою, наклеїти етикетку і помістити в холодильник. Хелат заліза зберігати в окремій посудині з темного скла.

6. Виготовити згідно з прописом концентровані розчини вітамінів. Для їх приготування беруть 10-разові наважки і розчиняють кожен вітамін окремо в 10 мл води. При цьому 1 мл цього розчину містить порцію вітаміну, необхідну для приготування 1 л робочого розчину за прописом Мурасиге-Скуга. Зберігають розчин у пляшечках-флакончиках з-під пеніциліну в замороженому стані.

Приготування розчинів фітогормонів.

Взяти 100 мг речовини ауксинів (2,4-Д, ІОК, НОК) і розчинити в 0,5-2 мл етанолу; цитокініни (кінетин, зеатин, БАП) розчинити в невеликій кількості 0,5н NaOH або KОН, абсцизову кислоту (АБК) - у 70%-му етанолі. Потім розчини підігрівають (крім АБК) і заливають водою до об'єму 100 мл (1 мл містить 1 мг гормону). У холодильнику їх можна зберігати за температури + 4°С, але не більше одного місяця.

На основі маточних розчинів готують живильне середовище М-С, яке використовуватиметься в наступних заняттях для одержання і культиву-вання калусних тканин, культивування апікальних меристем картоплі, суниці і т.д.

Послідовність приготування робочих розчинів (робочого живильного середовища) об'ємом 1 л.

1. У хімічний стакан об'ємом на 1 л налити дистильованої води приблизно до 400 мл.

2. Зробити наважку сахарози (30 г), додати її в стакан з дистильованою водою і повністю розчинити. Для кращого розчинення можна злегка підігріти.

3. Додати згідно з прописом середовища необхідну кількість маточних розчинів макросолей (50 мл).

4. Додати згідно з прописом необхідну кількість маточних розчинів мікросолей (1 мл).

5. Додати згідно з прописом даного середовища розчини вітамінів і регуляторів росту.

6. Виміряти рН розчину. Якщо рН не буде в межах 5,6 - 5,8, то його слід довести до норми додаванням до середовища лугу (0,1н KOH, NaOH) або кислоти (0,1н HCl).

7. У другий хімічний стакан налити 300 мл дистильованої води. У ній розчинити 7 грамів агар-агару, нагріваючи його на електроплитці і перемішу-ючи до повного розчинення.

8. Розчин гарячого агар-агару злити з розчином солей, вітамінів і сахарози і довести загальний об'єм дистильованою водою до 1 л.

9. Розлити живильне середовище в пробірки (приблизно на 1/3 об'єму), закрити їх ватними корками або алюмінієвою фольгою.

10. Простерилізувати живильне середовище в автоклаві згідно з режимом стерилізації.

Робота захищена балів.

Підпис викладача

Контрольні запитання: Яка роль складових поживних середовищ? Охарактеризуйте основні компоненти поживних середовищ і яку роль відіграє кожен із них? Які стандартні поживні середовища використовуються при розмноженні рослин в in vitro? Яка послідовність приготування поживних середовищ? Яка різниця між рідким і твердим поживним середовищем? Що теке маточний і робочий розчин і чим вони відрізняються?