Лекція 4. ПОЖИВНІ СЕРЕДОВИЩА
План:
4.1. Середовища для мікроклонального розмноження
рослин
4.2. Основні компоненти поживних середовищ для
культури тканин рослин
4.3. Поживні середовища для культивування тваринних клітин та тканин.
Розмноження рослин культурою
тканин включає вирощування нових поколінь рослин на штучному середовищі в
асептичних лабораторних умовах з дуже маленької частини тканини вихідної рослини.
Часто промислове розмноження рослин називають – мікророз-множенням або
розмноженням in vitro, що в
перекладі з латинської означає „в склі", оскі-льки більшість етапів
лабораторного розмноження проходить із використанням скляного посуду: колб і
пробірок та пластмасових контейнерів.
Фізіологічною
основою для проведення маніпуляцій з частинками тканин рослин, ви-користовуючи
засоби мікроклонального розмноження на початку минулого сторіччя було
відкриття, що всі живі клітини є тотипотентними
- при забезпеченні відповідних умов, можуть регенерувати цілісний
організм, котрий буде генетично ідентичним до вихідної рослини. Обмежуючим
фактором для застосування мікроклонального розмноження є не-обхідність
створення специфічних умов для успішного проведення цього процесу та вели-ка
кількість експериментів для встановлення оптимальних параметрів для кожного
виду рослин, що розмножуються в такий спосіб.
Мікроклональне розмноження
застосовувалося протягом багатьох років як один із ме-тодів наукового пошуку.
Більш як 20 років цей метод розмноження набув широкого прак-тичного
застосування - найчастіше це масове промислове розмноження цінних декоратив-них
і плодових культур, що погано розмножуються іншими способами.
Першими рослинами які розпочали масово розмножувати в культурі тканин
були ор-хідеї. В останні роки створені технології для успішного промислового
розмноження не ли-ше трав'янистих культур, а й дерев (підщепа для черешні серії
Gisela).
Проте не всі росли-ни можна успішно масово розмножувати у великих кількостях по
причині недостатнього опрацювання і адаптації технології для них, однак в
близькому майбутньому і ця причина може бути подоланою.
4.1.
Середовища для мікроклонального розмноження рослин
Основою для створення поживних середовищ
для вирощування культур тканин рос-лин є мінеральні солі (макро- і
мікроелементи) і, оскільки живлення культивованих тка-нин є гетеротрофним,
джерело вуглецю вводиться в склад середовища у вигляді сахарози або глюкози.
Крім вуглецю, кисню і водню, для росту
тканин необхідний азот у вигляді нітратної або амонійної солі, фосфор - у
вигляді фосфату, сірка - у вигляді сульфату та іони К+, Са2+,
Мg2+.
Загальна концентрація всіх мінеральних елементів найбільш висока у середовищах
Мурасіге і Скуга, Ніча, Гамборга і Шенка.
Відомі два види поживних середовищ, що використовуються для
культивування тканин:
- напівтверді
-
цей вид середовищ є найбільш поширеною формою і використовуєть-ся в більшості
промислових біотехнологічних лабораторій. Напівтверді середовища мають форму
геля з розчиненими в ньому елементами живлення та іншими компонентами, які
додаються під час приготування, коли середовище є теплим і знаходиться в
рідкому стані. Коли всі інградієнти змішані і охолоджені до кімнатної
температури середовище стає гус-тим, що дозволяє культивувати частини тканин
рослини на його поверхні або частково заглиблюючи їх в нього. Найпоширенішим
загущувачем для приготування поживних се-редовищ є порошковидний агар, очищений
екстрактом з морських водорослей. Агар є порівняно дешевим, напівпрозорим,
легко стерилізується автоклавуванням і має форму геля (густіє) при кімнатній
температурі.
При використанні агару його концентрація становить 0,5-1,0 % - при цьому
отриму-ємо зручне напівтверде середовище (гель). У концентраціях нижче 0,5 % -
середовище мо-же бути недостатньо густим щоб фізично підтримувати рослину
(експлант) на поверхні - він може потонути. При концентраціях більше 1 %
отримуємо дуже густе (тверде) сере-довище, що може гальмувати розвиток
експланта, особливо утворення коренів на третій стадії розмноження, по причині
більшого осмотичного тиску, ніж у клітині. Засвоєння мі-неральних речовин,
гормонів та інших компонентів рослинами в дуже густих середови-щах також
гальмується.
Інколи в якості загущувачів для середовищ використовуються і інші
речовини, нап-риклад „Сеlrite"
(Джелрайт) - поліцукри, які продукують бактерії Рseudomonas, в
резуль-таті застосування яких отримуємо надзвичайно прозорі середовища, що дає
змогу легко ідентифікувати в них розвиток грибів і бактерій.
Гелеподібні середовища забезпечують необхідну поверхню для культивування
тканин на більшості стадій, проте для формування кореневої системи не є
ідеальними.
Рідкі -
складаються з мінеральних речовин, вітамінів, гормонів та інших речовин
роз-чинених у дистильованій воді без агару. В таких середовищах для успішної
культури тка-нин необхідно проводити аерацію - застосовувати ротаційні мішалки,
металеві спіралі або фільтрувальний папір.
В
рідких середовищах краще розвивається коренева система експлантів, проте вони
не мають широкого промислового застосування з багатьох причин - переливання,
зміщення експлантів, погана підтримка рослин та ін. Рідкі середовища
застосовують в дослідних лабораторіях виключно для базових етапів культури
тканин таких, як культура калусу.
4.2.
Основні компоненти поживних середовищ для культури тканин рослин
За історію розвитку мікроклонального
розмноження запропоновано значну кількість видів компонентів для приготування
поживних середовищ. Основні з них це: Мурасіге-Скуга, Андерсона, Джемборга В5, середовище для деревинних
культур Woody Plant Vedi-um, WPM. Всі вони різняться видом і
співвідношенням компонентів. В промислових біо-лабораторіях рекомендовано і
найбільш широко використовуються середовища Мурасіге - Скуга (МS), яке стало стандартом для розмноження
трав'янистих рослин. На його основі модифіковані поживні середовища для
продукування картоплі (модифікація інституту ка-ртоплярства, суниці – інституту
садівництва та інші).
Основні складові поживного середовища
поділяють на три класи: неорганічні солі; ор-ганічні речовини; природні
компоненти речовин.
Сполуки, необхідні для успішного росту
клітин in vitro
та
регенерації, поділяють на пять класів: неорганічні макро- та мікроелементи; джерела вуглецю та
енергії; вітаміни; відновлений азот; фітогормони.
До складу всіх поживних середовищ входять:
Макро
-і мікросолі представлені азотом, фосфором, сіркою та залізом. В складі
біль-шості поживних середовищ азот представлений у вигляді нітрату і лише в
окремих сере-довищах (Мурасіге і Скуга, Гамборга та ін.), крім нітратів,
додають солі амонію. Нітрати, як основне джерело азоту, вводяться в середовище
в концентрації від 2 до
Азот у складі більшості живильних середовищ
представлений у вигляді нітрату і лише в деяких середовищах (Мурасіге і Скуга,
Гамборга та ін.), крім нітратів, додають со-лі амонію. Нітрати, як основне джерело азоту, вводяться в середовище
в концентрації від 2 до
Існує чітка кореляція між збільшенням
сирої маси суспензії клітин рослин і викорис-танням нітратів із середовища, що
свідчить про значне перетворення нітратів в органічні сполуки.
Виявлено, що в клітинній суспензії
тютюну Nicotiana
tabacum є
активна, залежна від енергії система надходження нітратів у клітини. Вона
індукується нітратом і пригні-чується амінокислотами. Заміна 10-20 % нітратів
на солі амонію сприяє кращому росту тканини.
Фосфор
є необхідним компонентом росту
калусних тканин та ізольованих органів, який вводиться в склад поживного
середовища у вигляді ортофосфату. Джерелом фосфор-ного живлення можуть бути
фосфати цукрів. Іони Na+, Сl-, S042- потрібні для
культиву-вання тканин у невеликих кількостях і які важливі при
регулюванні рН середовища.
Сірку вводять до складу живильного середовища у вигляді
сульфату, сульфіту, цистеї-ну, глутатіону або метіоніну.
Залізо
вводиться у вигляді неорганічних солей (FеСІ2, Fе2(S04)3 і солей
органічних кислот (лимоннокисле залізо). Доцільним є введення хелатуючих
реагентів, таких як ети-лендиамінтетраоцтова кислота (ЕДТА), яка покращує
засвоєння заліза при широкому діа-пазоні рН.
Крім основних макроелементів, до складу
більшості середовищ вводять мікроелемен-ти (цинк, бор, молібден, марганець та
інші). Введення мікроелементів у середовище не-минуче, оскільки солі
макроелементів, які використовуються, не завжди їх містять.
Вуглеводи є не замінимими компонентами поживних середовищ для
культивування ізольованих клітин і тканин, тому що в більшості випадків не
здатні до автотрофного жив-лення.
Найчастіше джерелом вуглеводів використовують сахарозу або
глюкозу в концент-раціях 2-4
% (20-40 г/л), або
звичайний цукор. Поліцукри, як правило, не використовують як джерело
вуглецевого живлення; але оскільки деякі тканини, наприклад пухлинні, містять
активні гідролітичні ферменти (амілаза та ін.), вони можуть рости на
середовищах з розчиненим крохмалем.
Вітаміни. Їх вплив на розвиток тканин
при мікроклональному розмноженні вивчена недостатньо, проте більшість
вітамінів, що входять до складу поживних середовищ при певних концентраціях стимулюють
процеси росту і розвитку клітин та інші важливі реак-ції. Зокрема, тіамін
(вітамін В1) входить до складу піруватдекарбоксилази і відіграє
важ-ливу роль у перетворенні вуглеводів, а також в окислювальному
декарбоксилюванні кето-кислот. До складу середовищ тіамін вводиться в кількості
0,1-10 мг/л, а в окремі і піридок-син (вітамін В6), який бере участь
у процесах декарбоксилювання та переамінування амі-нокислот. Нікотинова кислота
у вигляді аміду входить до складу окислювально-відновних ферментів -
дегідрогеназ. В поживні середовища нікотинова кислота вводиться в концент-рації
0,5-1 мг/л. Можливе використання піродоксину, іноситолу, пантотеїнової кислоти
(0,1 мг/л), біотину (0,1 мг/л).
Для росту і диференціації будь-яких
рослинних клітин необхідні регулятори
росту (ауксини та цитокініни). Оскільки різні клітини і тканини в культурі
значно відрізняються за здатністю до автономного синтезу та метаболізму окремих
фітогормонів, тому їх ріст в значній мірі залежить від присутності екзогенних
регуляторів росту. Відмінності у потребі в екзогенних ауксинах та цитокінінах
дозволяють виділити декілька груп тканин:
-
тканини, які ростуть на середовищі з ауксинами (експланти топінамбура, корені
цикорію);
-
тканин, для росту яких потрібні тільки цитокініни (культура кінчика корінця
бі-лого турнепса);
-
тканини, для росту яких необхідні ауксини і цитокініни (культивовані первинні
експланти тютюну, тканини кореня моркви);
- тканини, які ростуть
на середовищах складного складу;
-
культури тканин - пухлин, що здатні рости на середовищах без регуляторів росту.
Для отримання і підтримання культур
тканин використовують: ауксини: індолілоцто-ву кислоту (ІОК) в концентрації
1-30 мг/л, а-нафтилоцтову кислоту (НОК) в концентрації 0,1-0,2мг/л та 2,4 -
дихлорфеноксиоцтову кислоту (2,4-Д) в концентрації меншій, ніж 1мг/л. Для
індукції утворення калусу, як правило, використовують вищі концентрації
аук-синів, а при наступних пересадках тканина може рости при зменшеному у 10
разів вмісті ауксинів. Для росту клітин і органів рослин в культурі in vitro як цитокініни використову-ють: кінетин
(Кін), 6-бензиламінопурин (БАП) та. ін. Змінюючи склад фітогормонів мож-на
регулювати утворення коренів, листків, квіток, пагонів або зародків, з яких
розвинеться рослина. При додаванні фітогормонів відбувається ріст різноманітних
меристем. Клітини меристем відрізняються від клітин калусу меншим розміром і
бльшим ядром та щільні-шою цитоплазмою.
При більшому вмісті ауксинів - розвиваються кореневі меристеми, ци-токінінів –
утворюються стеблові пагони та бруньки.
Фітогормони (регулятори росту) це
фундаментальна основа при маніпуляціях з тканинами рослин при їх розмноженні, забезпечуючи
природний баланс гормонів рослини і стимулює ті чи інші фізіологічні зміни в її
рості і розвитку. До них належать ауксини, цитокініни та гібереліни. Ауксин та
цитокінін є стабільними сполуками і їх можна стери-лізувати автоклавуванням,
гібереліни - нестабільні і при стерилізації інактивуються. Тому для одержання
калусних тканин в склад поживних середовищ обов'язково входять аукси-ни, які викликають клітинне
дедиференціювання і цитокініни, які
індукують поділ деди-ференційованих клітин. Для індукції стеблового морфогенезу вміст ауксинів може
бути знижений або вони можуть бути повністю виключені. На середовищах без
гормонів ростуть пухлинні і "привиклі" тканини. Автономність по
відношенню до двох гормонів або одному з них пов'язана із здатністю цих клітин
продукувати гормони
Стимулювання галуження експланта можливо
досягти шляхом збільшення концент-рації цитокініну,
що досягається додаванням його до середовища. Цитокінін - це
природ-ний регулятор росту рослини (гормон), який регулює кількість та
інтенсивність росту бічних пагонів в рослині. Додавання штучно синтезованого
цитокініну: кінетин, зеатин, N6 - бензиладенін (ВА), N6 - ізопентиладенін (2іР),
до поживного середовища є переду-мовою успішного галуження експланта в
процесах, які його вимагають. Робоча концент-рація цитокініну від 0,01 до 10,0
мг/л, оптимальна - 0,1 - 5,0 мг/л, яка використовується в більшості середовищ,
що застосовуються при промисловому мікророзмноженні.
Механізм дії цитокініну полягає в пригніченні росту термінальної
(апікальної) точки росту пагона і стимулюванні росту латеральних бруньок, що
призводить до утворення чи-сленних пагонів, що і є метою і головним завданням
розмноження рослин в культурі тка-нин.
Заключним етапом мікророзмноження є вкорінення отриманих пагонів.
Стимулювати цей процес можна за допомогою гормонів - ауксинів, котрі активізують апікальний ріст рослини і
утворення коренів. Для досягнення такого ефекту до середовища додають
синтетично синтезовані ауксини: індоліл - 3 - оцтову кислоту (ІАА), індоліл - 3
- масляну кислоту (ІВА), a-нафтилоцтову кислоту (КАА) в концентрації
0,1-10 мг/л. Практикується застосовування 2,4-D (2,4 дихлорофеніксиоцтову кислоту) в
концентрації 40-120 мг/л. Найбільш часто застосовують 2,4 Д, тому що ІОК майже
в 30 разів менш активна, ніж 2,4 Д. Для індукції калусу необхідні високі
концентрації ауксинів (частіше це 2,4 Д), при наступних пересадках (пасажуванні)
їх зменшують. Як джерело цитокінінів
в штучних живильних середовищах використовують кінетин, 6-бензиламінопурин (6
- БАП), зеатин (0,001 - 10,0 мг/л). 6 - БАП і зеатин у порівнянні з кінетином
більш активні по відношенню підтримки росту ізольованих тканин і індукції
органогенезу. В склад деяких поживних середовищ входить аденін.
Гібереліни - гіберелінова кислота (GАз) - не є основним
компонентом поживних сере-довищ, проте може використовуватися для активізації
(витягування) росту пагонів в дов-жину у культур, в яких повільно ростуть
пагони.
Регулятори росту повинні зберігатися в холодильнику при низькій
температурі (біля 0 °С), де вони з часом втрачають активність. Всі гормони
розчиняються в органічних розчинниках, об'єм яких не більше 0,5 % від кінцевого
об'єму приготовленого середови-ща. Цитокініни є слабкими лугами і можуть бути
розчинені в розчинених кислотах з послідуючим розбавленням у воді до
необхідного об'єму. Ауксини є слабкими кислотами і можуть бути розчиненими у
розчині слабкого лугу або спирту. На практиці викорис-товують 0,3 мл 1н НСl для розчинення цитокініну або NаОН для ауксину на кожні 10 мг гормону (табл. 4.2.1).
Таблиця 4.2.1.
Роль фітогормонів в процесах росту і розвитку рослин
|
Ауксини |
Цитокініни |
Гібериліни |
|
Ріст
стебла |
||
|
Сприяють збільшенню розмірів клітин нижче за точку росту.
Сприяють поділу клітин камбію. |
Стимулюють поділ клітин в апікальній меристемі і камбію.
Іноді інгібують фазу розтягу клітин. |
Сприяють збільшенню клітин у при-сутності ауксинів. Крім того,
сприя-ють поділу клітин апікальної мерис-теми і камбію У деяких розеткових рослин сприяють «виходу
в стрілку» |
|
Ріст
кореня |
||
|
При дуже низьких концентраціях стимулюють. При більш
високих пригнічують (геотропізм) |
Неактивні або сти-мулюють ріст пер-винних коренів |
Неактивні |
|
Ініціація
росту коренів |
||
|
Сприяють формуванню коренів на живцях і калусах |
Неактивні, чи спри-яють росту бічних коренів |
Інгібують |
|
Ініціація
утворення бруньок (пагонів) |
||
|
Діють як антагоністи цитокінінів, однак іноді при знятті
апікального домінування стимулюють ріст па-гонів |
Стимулюють |
При знятті апікального домінування стимулюють ріст
пагонів |
|
Ріст
листків |
||
|
Неактивні |
Стимулюють |
Стимулюють |
|
Ріст
плодів |
||
|
Стимулюють, іноді викликають партенокарпію |
Стимулюють, іноді викликають партено-карпію |
Стимулюють, іноді викликають партенокарпію |
|
Домінування
верхівки |
||
|
Посилюють, тим самим приг-нічуючи ріст бічних бруньок |
Антагоністи аукси-нів, стимулюють ріст бічних бруньок |
Посилюють ріст ауксинів |
|
Стан
спокою в бруньках |
||
|
Неактивні |
Порушують |
Порушують |
|
Стан
спокою в насінні |
||
|
Неактивні |
Порушують |
Порушують |
|
Цвітіння |
||
|
Як правило, неактивні |
Як правило, неактивні |
У рослин довгого дня стимулюють. У рослин короткого дня
сповільню-ють |
|
Старіння
листків |
||
|
У деяких рослин сповільню-ють |
Сповільнюють |
У деяких рослин сповільнюють |
|
Опадання плодів |
||
|
Сповільнюють (в окремих випад-ках стимулюють) |
Неактивні |
Неактивні |
|
Вплив на продихи |
||
|
Неактивні |
Сприяють відкриван-ню |
Неактивні |
Інші складові. Результатами наукових досліджень доведено
позитивний вплив на тка-нини гідролізату (витяжки) протеїну із казеїну (30-3000
мг/л), що є джерелом органічного азоту і амінокислот. Кокосове молоко (10-20%
), мальтоза (500 мг/л), екстракт дріжджів (50-5000 мг/л), томатний сік (30%), апельсиновий
сік (30%), бананове пюре, лимонна кис-лота (150 мг/л), аскорбінова кислота (10
мг/л), які використовуються як антиоксиданти для запобігання коричневіння
тканин. Всі ці компоненти можуть додаватися до середовищ під час їх
приготування, проте не можуть автоклавуватися оскільки стерилізація
проводи-ться шляхом фільтрування через нанофільтри.
Для вирощування в культурі тканин окремих видів рослин до середовищ
приготов-лених на основі агару додають активоване вугілля, особливо на стадії 3
- укоріненні експлантів. Активоване вугілля додається в концентраціях 0,1-3 %,
позивний вплив якого виражається у:
-
стимуляції розвитку коренів (3 стадія розмноження), оскільки вважається, що
наяв-ність в середовищі активованого вугілля надає йому темного забарвлення і
світло не так інтенсивно проникає до зони утворення коренів - в темноті вони
утворюються активніше;
-
запобіганні утворення не бажаного розвитку калусу в точках росту культури;
-
адсорбції з середовища і самої рослини сполук, що пригнічують ріст і розвиток
куль-тури;
Застосування активованого вугілля має і свої недоліки - темне
забарвлення середови-ща значно ускладнює виявлення розвитку патогенної флори
(грибів і бактерій), тому необ-хідно більш ретельно проводити інспекції -
браковки. При експорті рослин в культурі тка-нин заборонено застосовувати
середовища з додаванням активованого вугілля, оскільки карантинні служби не в
стані ідентифікувати наявність розвитку патогенних організмів. Застосування в
середовищі активованого вугілля завжди послаблює дію гормонів. Для індукції
первинного калусу і рідше для підтримки його росту до поживного середовища
іноді додають рослинні екстракти або соки. Найбільшу здатність активізовувати ріст має кокосове
молоко - рідкий ендосперм кокосового горіху.
Для
приготування твердих поживних середовищ використовують агар-агар. Це – по-ліцукри,
які одержують з морських водоростей і виготовляють у вигляді пластин, зерен або
жовтувато-білого порошку. Агар-агар потрібно попередньо добре промити від
домі-шок. Найменшу їх кількість містить бактеріальний агар зарубіжного виробництва
“Bacto-Agar” (фірма США). Такий агар можна використовувати для приготування
поживних середовищ без попереднього промивання. Переважно для одержання
твердого поживного середовища до нього додають 0,3-0,7 % агару. Агар-агар утворює з водою
гель, який пла-виться при 100 °С і твердне при 45 °С. Відомо, що в нативних
умовах рослинна клітина функціонує у вузьких межах коливань концентрації
водневих іонів. Відносна стабільність величини рН всередині клітини та
середовищі, яке її оточує, підтримується буферними си-стемами, в яких важливу
роль відіграють білкові молекули як амфоліти. Відносно стабі-льне значення рН у
середовищі підтримується за рахунок хелатуючих реагентів або від-повідних
сполук. Більшість стаціонарних культур ізольованих тканин росте на середо-вищах
з рН 5,6-5,8.
З метою економії часу розчини
макросолей, мікросолей, вітамінів і фітогормонів виготовляють концентрованими,
що дозволяє багаторазово їх використовувати. Концент-рація
розчинів макросолей повинна бути більшою в 10-20 разів, мікросолей в 100-1000
ра-зів, вітамінів - в 1000 разів. Концентровані (маточні)
розчини зберігають в холодильнику, причому вітаміни зберігають при
мінусовій температурі (в морозильній камері).
Реакція
середовища - є визначальним показником придатності
середовища для росту рослин і агрегатного стану самого середовища, оскільки
рослини добре розвиваються при рН 5,5, при більш кислій реакції середовище буде
залишатися в рідкому стані оскільки агар в таких умовах не активний. Корекцію
рН проводять шляхом додавання 1н НС1 або 1н NаОН до необхідного значення.
Розчинник. Універсальним
розчинником для приготування середовищ є дистильована вода.
Для культивування клітин, тканин і органів тих чи інших рослин
використовують по-живні середовища різного складу: Мурасінге - Скуга (М-С);
Уайта (VH);
Гамборга (В5); Шенга - Хільбранта, (SH) (табл.
4.2.2).
Готові
середовища. В більшості країн доступними
через спеціалізовану мережу є го-тові сухі суміші для приготування поживних
середовищ, для використання вони вима-гають лише розчинення у дистильованій
воді.
Таблиця 4.2.2. Склад поживного середовища (вміст
в живильному середовищі, мг/л)
|
Компоненти |
Мурасінге, Скуга, (М8) нге, Скуга |
Гамборга, (Б5) |
Уайта, (VH) |
Шенга, Хільбранта, (SH) |
|
Макроелементи |
||||
|
NН4NОз |
1650 |
- |
- |
- |
|
КNOз |
1900 |
2500 |
80 |
2500 |
|
СаСІ2 х
2Н2O |
440 |
150 |
- |
200 |
|
Мg3O4 х 7Н2O |
370 |
250 |
737 |
400 |
|
КН2РO4 |
170 |
- |
- |
- |
|
(NН4)2O4 |
- |
134 |
- |
- |
|
NaН2РO4 х 2Н2O |
- |
150 |
19 |
- |
|
(СаNO3)2 х 4Н2O |
- |
- |
288 |
- |
|
КСІ |
- |
- |
65 |
- |
|
Nа2SO4 |
- |
- |
200 |
— |
|
МН4Н2РO4 |
- |
- |
- |
300 |
|
Мікроелементи |
||||
|
КІ |
0,83 |
0,75 |
0,75 |
1 |
|
НзВОз |
6,3 |
3,0 |
1,5 |
5 |
|
Мn3O4 х 4Н2O |
22,3 |
13,2 |
6,65 |
13,2 |
|
ZnSO4 х 7Н2O |
8,6 |
2,0 |
267 |
1 |
|
Na2МоO4 х 2Н2O |
0,25 |
0,25 |
- |
0,1 |
|
МоO3 |
- |
- |
0,0001 |
- |
Таким чином, успіх в культивуванні
культур клітин, тканин та органів рослин визна-чається складом поживних
середовищ. На даний час розроблено багато варіантів пожив-них середовищ.
Найбільш використовуваними є: Мурасіге, Скуга - МS [Murashige, Skoog, 1962],
Гамборга та ін. - В5 [Gamborg et al., 1968], Ф. Уайта - WH [White, 1963], Р.
Шенка, Хільдебранта - SH [Schenk, Hildebrandt, 1972]. Макро- та мікроелементи
середовища MS також ідентичні до середовища LS [Linsmaier, Skoog, 1965].
4.3.
Живильні середовища для культивування
тваринних клітин та тканин.
Після виділення клітин
тварин з тканини або організму і введення їх в культуру, по-живне середовище
повинно забезпечувати всі необхідні зовнішні умови, які клітини мали in vitro: виживання клітин, їх проліферацію і диференціювання. Позаклітинне
середовище повинно забезпечувати клітини поживними і гормональними факторами,
тобто володіти всім необхідним для росту і виживання клітин.
Культури клітин тварин і людини
пред'являють певні вимоги до рідкої (поживне сере-довище), газоподібної
(концентрація газів) і твердої (поверхня субстрату) фази. Живильне середовище є
розчином певного складу, до якого додаються певні компоненти біологіч-ного
походження (добавки плазми, сироватки крові, тканинні екстракти…). Основу
пожи-вних середовищ складають сольові розчини, мінеральні компоненти які
підібрані таким чином, щоб розчин виконував буферні функції, підтримуючи
постійний кислотно – луж-ний баланс в процесі культивування. Постійність рН середовища є одним з головних вимог умов
культивування.
Для приготування живильних середовищ
використовуються сольові розчини Ерла і Хенкса. Їх, як і фосфатно - сольовий
буфер Дульбекко і Фогта, використовують для виро-щування і стерилізації клітин
при пасажуванні культур, виділенні клітинних ліній і в ін-ших маніпуляціях з
культурами клітин. Іншою важливою умовою культивування є осмо-тичний тиск. Він
визначається числом молей осмотично активних частин (іонів і неіоні-зованих
молекул) розчинених речовин на
Стандартні середовища для поліферації
культур тваринних клітин.
Середовища Ігла MEM (minimal essential medium) і BME (basal medium, Eagle). Частіше використовується МЕМ, до складу
якого входять мінеральні речовини, амінокислоти (13 незамінних), 6
во-дорозчинних вітамінів, холін і інозит, що виконують роль вуглеводневого
субстрату. МЕМ використовується тільки з сироваткою, оскільки в ній відсутні
біотин, вітамін В12, іони заліза і мікроелементи, що є основою
розчину Ерла.
Середовище
Дульбекко DME або DMEM (подвійна модифікація середовища Голка). Використовується
при культивуванні клітин різних типів, зокрема нетрансформованих клітин і гібридом. Є
основою для безсироваткових середовищ. Містить подвійну конце-нтрацію
амінокислот, гліцин, серин, піруват, залізо. При його використанні необхідний
ін-кубатор з 10% концентрацією СО2.
Середовище
Іськова IMDM (модифікація середовища
Дульбекко). Додані незамінні амінокислоти, біотваней, вітамін В12,
селеніт натрію. В середовище введений HEPES і
зменшені концентрації NaCl і NaHCO3. Використовується
для культивування лімфоцитів і кровотворних клітин.
Середовище Маккоя 5А і
серія середовищ RPMI.
Середовище Маккоя 5А
розроблене в 1958 році для підтримки клонального росту клітин карцино-саркоми
Уолкера 256 в присутності сироватки та інших первинних культур і різних
клітинних ліній. Зазвичай проводиться в модифікації Івката і Грейса (RPMI) і призначена для культивування
лей-коцитів у присутності сироватки та для культивування гібридом.
Концентрація СО2 при культивуванні 5%.
Середовище
199 розроблене в 1950 році для культивування фрагментів серця з ембріона
курчати. Для середовища характерні широкий спектр поживних речовин і невисока
їх концентрація. Використовується без добавок для росту первинних клітин, а з
сироваткою як середовище для проліферації клітин, що швидко розмножуються. Для
оп-тимального росту клітин зазвичай додають 5-20 % ембріональної сироватки, яка є надзви-чайно
складною сумішшю дрібних і крупних молекул, здатних як викликати, так і
гальму-вати ріст клітин. До головних функцій сироватки відносять: забезпечення
гормональними складовими, які стимулюють
ріст і розвиток клітин і їх функції; створення умов для про-ліферації клітин;
забезпечення транспортними білками, що переносять гормони, мінера-льні
речовини, ліпіди.
Більшість ростових факторів присутні в
сироватці в концентрації декілька нанагра-ммів на міллілітр і
нижче. Деякі з них специфічні для клітин
на певній стадії диферен-ціювання, дія інших не обмежена якимось одним
типом клітин. Один і той же тип клітин може стимулюватись різними ростовими
факторами. Наприклад, фібробласти розмножу-ються у відповідь на ріст
фібробластів, ріст епідермісу зумовлюється синтезом тромбоци-тів і
соматомединів. Всі ці речовини є мутагенами (стимулюють мітоз). Іншим важливим
фактором росту практично для всіх типів клітин є гормон інсулін. З інших
гормонів най-частіше застосовуються глюкокортикоїди (гідрокортизон,
дексаметазон), стероїди (естра-діол, тестостерон, прогестерон) і гормони
щитовидної залози, які стимулюють або пригні-чують ріст залежно від типу клітин
і їх щільності. Глюкокортикоїди впливають на пролі-ферацію клітин, змінюючи їх
чутливість до фаторів росту.
Для перенесення низькомолекулярних
речовин (вітамінів, ліпідів і інших) необхідні транспортні білки. В цій ролі
виступає альбумін. Транспорт заліза забезпечує трансферин, а поверхня більшості
культивованих клітин містить рецептори для цього білку. До фак-торів
прикріплення і розщеплення клітин відносяться колаген і фібронектин, більш
спеціа-лізовані хондронектин (адгезія хондроцитів) і ламінін (адгезія
епітеліальних клітин).
В даний час розроблені безсироваткові середовища, найчастіше, вузькоспеціалізовані,
призначені для певного типу клітин. До базового середовища додається інсулін,
транс-ферин, гідрокортизон або його аналог дексаметазон. Безсироваткові
середовища мають переваги: поліпшення відтворюваності результатів досліду
внаслідок більшої стабільності складу середовища; зниження ризику зараження
культури вірусами, грибами, мікоплаз-мою; полегшення очищення продуктів
клітинного метаболізму; зниження впливу додат-кових білків на результати
біологічних досліджень; відсутність цитотоксичності сироват-ки. Культивування
клітин в присутності сироватки має і ряд недоліків:
- для більшості тканин сироватка не є
фізіологічною рідиною, з якою вони контакту-вали у вихідній тканині, викликаючи
ріст фібробластів та гальмує ріст епідермальних ка-ратиноцитів;
- може бути цитотоксичною, оскільки
містить поліаміноксидазу, що діє на поліаміни (спермін, спермідин), секреції,
що є продуктами, швидко проліферуючих клітин (ембріо-нальна сироватка містить
відносно багато такого ферменту);
- значна варіабельность складу сироваток
різних партій;
- можуть містити недостатню кількість специфічних
ростових складових, що викликає необхідність введення їх в культуру клітин.
Основним матеріалом який використовують
в якості ємкості (посуду) є: скло (краще алюмоборосилікатне скло); пластик
(полістирол, полікарбонат, полівінілхлорид, тефлон та інші); метал (нержавіюча
сталь, титан).
